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(無題) 削除/引用 No.3581-24 - 2014/11/28 (金) 14:32:04 - 774 ~さん ありがとうございます。 確かに凍らせなければ同じですね。 ラボ内で同意してもらえるか聞いてみます。 APさん 液体を４℃と勘違いしておりました。 お恥ずかしい限りです。

(無題) 削除/引用 No.3581-23 - 2014/11/28 (金) 00:01:18 - AP 4℃で保存というのは、粉末の試薬の話です。製品によって保存の指定が冷蔵だったりフリーザだったりします。冷蔵保存に従っているといきなり力価が落ちることがありますね。

(無題) 削除/引用 No.3581-22 - 2014/11/27 (木) 10:22:45 - ~ >[Re:21] 774さんは書きました : > ４℃で保存できたら楽だな。なんて思っちゃいました。 直接の回答ではありませんが、私が大腸菌を使うラボにいた時は、 アンピシリンを50%エタノール水溶液に溶かして‐20℃で保存していました。 この濃度であれば溶液は‐20℃で凍りませんし、半年以上は使えていました。 ただし、引火しますので、チューブの口をガスバーナーであぶらないように気を付ける必要があります。

(無題) 削除/引用 No.3581-21 - 2014/11/27 (木) 08:45:53 - 774 横からすみません。 ４℃での保存はどれくらいの期間有効なのでしょうか？ 経験的なもので結構ですので、教えて頂ければと思います。 私のラボではアンピシリン100mg/mlを-20℃で保存して、 毎回溶かして使ってます。 凍結融解は20回以上になりますが、今のところ問題はないようです。 ４℃で保存できたら楽だな。なんて思っちゃいました。

(無題) 削除/引用 No.3581-20 - 2014/11/27 (木) 04:28:32 - pH Sigmaによると、ampicillin の液のpHが安定性にかかわるとしています。 >Although ampicillin in any form is　more readily soluble in base, it rapidly loses activity when stored above pH7.0. https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Product_Information_Sheet/a9393pis.pdf よって、 pH7.5　とか普通のpHでも問題が起きることがあります。また、そのampicillin の塩かどうか（Ｎａとか）でもそのストック溶液の最終pHがかわるので、チェックが必要です。-20度に小分けすること自体は問題なし。ampicillin プレートが疑わしいときは、-20度に小分けしたampicillin をプレートに撒いて乾かすというのもあり。 ampicillin の不安定性の問題はよく聞きますね。

(無題) 削除/引用 No.3581-19 - 2014/11/27 (木) 01:48:38 - おお そのlotが悪かったんでしょうかね。。。メーカーにそのロットで苦情がきてないかとかきいてみてはどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3581-18 - 2014/11/26 (水) 10:13:11 - DH5alpha おお様、~様、 ひぃぃ様 コメントいただきありがとうございます。 コンピの作製の注意点について指摘してくださりありがとうございます。 次回作製するような機会がありましたらそのようにfiltrationを行う事にします。 原因が判明しました。 これまで問題なかった一週間とそれ以降で変わった点、それはプレートを作り直したことでした。 水やLB brothも新しく調製し、Ampも粉から作製してもダメでしたが、Ampをストックがありましたので、それを解凍し、作製したところ問題なくligation産物の数個のコロニーのみが生えました。 これまでまったく問題なかったampcillinですが、なぜこのように活性がなくなってしまったのか不明です。50 mg/mlをmilliQで調製して-20度でストック、4度でaliquatを保存していました。 ampの粉は4度の冷蔵庫で、フタを開ける際は室温に戻してから使っていました。 ひとまずLBプレートの表面に、この活性のあるAmpを塗って、ampが届くまで今後しのごうと思います。みなさまありがとう御座います。

(無題) 削除/引用 No.3581-16 - 2014/11/25 (火) 10:59:50 - ~ コンピのコンタミ説も結構出ているので、その確認として、 今日のうちに、コンピ(冷凍品)をチップの先で書き取り、 アンピシリン入りLBプレートにストリークしておいてはいかがでしょうか。 明日の朝には、コンタミでなければその判定ができると思います。 もう少し丁寧に確認するのであれば、 ・適当なアンピシリン耐性遺伝子入りプラスミドで形質転換して、1/100量, 1/10000量、残りをプレートに撒く ・何もプラスミドを入れずに、1/100量, 1/10000量、残りをプレートに撒く でコロニー数を比較してみてもいいのかもしれません。 また、昔のコンピが余っていれば、それとの比較もいいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.3581-15 - 2014/11/25 (火) 07:33:18 - ひぃぃ 自分が井上法やるときは、 ・Buffer自体は正確に調整、その後滅菌した瓶に0.22µmフィルターを通して入れる ・コンピの調製操作は全て外 ・氷上で分注してそのままディープフリーザーへ という感じです。メスシリンダーは調製で使うだけで、最終的にはフィルターを通して いるのでバッファー自体は無菌状態であると言えます。 実際にペレットを懸濁する量は厳密である必要はなく、チューブの目盛を使っても問題 はないかと思います。というかあの目盛を使ってもそう大きなズレは起きません。 後、インキュベーターのコンタミでそんなに菌がシャーレの中に侵入するとは考えずらい のですが。。。逆さまにしている以上強い風を吹きかけない限りは芽胞や胞子等が侵入 する事は珍しいかと思います。たまにカビがインキュベーターに生えていたりしますが それでもシャーレが汚染される事はほとんど見たことがありません。 どうなんでしょうね。一般的に。多いんでしょうかこういった事例。 高確率でコンピテントのコンタミだと思いますけどね。

(無題) 削除/引用 No.3581-14 - 2014/11/24 (月) 14:35:25 - ~ おおさんの書かれている、コンピが濃すぎるを体験したことがあります。 次に操作される時は、形質転換後の液の1/100~1/1000くらいを1枚のプレートにまいてみては？ また、きちんと変更点を洗い出してみてはいかがでしょうか？ ・コンピ ・プレート ・プラスミド あたりで、おかしくなった前後で変わったもの、変わっていないものを確認してみましょう。

(無題) 削除/引用 No.3581-13 - 2014/11/24 (月) 11:39:45 - おお そのコンピの菌体の濃度濃すぎるとかないでしょうか、そうだとなおさら、関係のない菌をたくさんまいていることになる。 昔の問題のあるコンピもそんな感じでした。

(無題) 削除/引用 No.3581-12 - 2014/11/24 (月) 11:21:36 - DH5alpha TS様、重ねてお礼申し上げます。 はい。今TOP10とAmpicillinをいただいたので、それでまずは行ってみます。 弘法様 すみません存知あげませんでした。そうなのですね。では酵母以外のamp耐性菌が増えているということですね。 おお様、重ねてお礼申し上げます。 はい。コンピはシングルコロニーを拾いました。 ただ、最初stockをthawして、希釈したものを抗生剤フリーのLBに撒いた後、12 hrsではコロニーが増えてこなかった（あるいは小さ過ぎた）記憶があります。18時間ほど待ってようやくピックできるシングルコロニーを拾いました。 これまで30-40回以上も形質転換を行ってきましたが、これほどまでに問題になることはありませんでした。ファージの可能性もあるのでしょうか…形質転換、プレーティング後、5時間ほどでプラートの辺縁が白濁し、モヤモヤが時間とともに顕著に大きくなって行きます。

(無題) 削除/引用 No.3581-11 - 2014/11/24 (月) 10:39:41 - おお >[Re:8] DH5alphaさんは書きました : > おお様ありがとうございます。 > 厳密に滅菌状態で作製しませんでした。参考にした資料ではメスシリンダーまで滅菌すると書かれてあったかと思いますが、そこまではしなくてもいいんだということになりました。 まあラフにやっても大丈夫なところもあるんですけど、要所要所はしめておかないと。滅菌してないメスシリンダーをつかうよりは、あらかじめ必要量のめっきんした溶液を用意しておいて計量せずにやり通すとか、そっちの方をラフにやった方が無難かと。 コンピを作成するとき、シングルコロニーから増やしてますよね。 あと確かに酵母は早い段階でははえてきません。もし生えたなら、コンピの大部分はすでに酵母の可能性がありますが、そこまでひどくなっているだろうかと、、、

(無題) 削除/引用 No.3581-10 - 2014/11/24 (月) 09:17:09 - 弘法 酵母は大腸菌などのバクテリアに比べると増殖がずっと遅いので、５時間後に生えてくるものは酵母ではあり得ません。

(無題) 削除/引用 No.3581-9 - 2014/11/24 (月) 09:07:44 - TS とりあえずコンピを購入するか、他のラボから分けてもらってはどうですか。

(無題) 削除/引用 No.3581-8 - 2014/11/24 (月) 05:15:55 - DH5alpha おお様ありがとうございます。 このコンピテントセルは先輩とともに作製したもので、井上法という方法にならって作製したものです。ただ当時も先輩と話したことですが、厳密に滅菌状態で作製しませんでした。参考にした資料ではメスシリンダーまで滅菌すると書かれてあったかと思いますが、そこまではしなくてもいいんだということになりました。 二ヶ月前に作ったそのコンピのバッチは200本ありましたが、これまで全く問題なく、残り100本ほどあります。今思えばですが、これまで上手く行ってはいましたが、たまにサテライトなのか、小さな点々がまばらに生えたことがありました。ただ、大腸菌の方が成長が早かったため無視でき、目的のものを拾えていました。今思えば、コンピにコンタミしていた可能性が高いですね。 下のコメントにも書かせていただきましたが、実はincubatorもそのせいか汚染されている印象です。 今日漂白剤とアルコールで実験台とincubatorを清掃しました。というのも、いつもは使わないincubatorで培養したところ3 dishesともコンタミらしきものの成長がdishの辺縁部（エアレーションがかろうじて行き届いているところ？）のみにおさまりました。

(無題) 削除/引用 No.3581-7 - 2014/11/24 (月) 04:14:38 - おお ちなみにうちのコンピはむかしシングルクローンを拾わずやっていたようで、transformationしたやつにある一定以上の量プレートにまくと、一面に生えてくるのでびっくりしたことがあります。

(無題) 削除/引用 No.3581-6 - 2014/11/24 (月) 03:06:36 - おお コンピテントになにかamp耐性の菌がまじっていてドミナントになっているか、ampがだめになってるかどちらかだと思います。

(無題) 削除/引用 No.3581-5 - 2014/11/24 (月) 02:13:00 - DH5alpha yyy様ありがとうございます。 はい、ナトリウム塩を使用しています。 Ampのへたりを疑って2倍まであげましたが、かわりませんでした。 AmpやLBのpHは測定していないので、測定してみます。

(無題) 削除/引用 No.3581-4 - 2014/11/24 (月) 02:10:24 - DH5alpha TS様ありがとうございます。 コンピのコンタミは、これまで問題なく使えていたので、疑いませんでした。 確かにそのコントロールが一番ですよね。量が限られていたため使うのを惜しんでしまいました。 今朝、LB, Ampなど全てを作り直して、同じバッチのコンピに形質転換を行った後、いつもの37度のincubatorに入れましたが、入れてすぐ（約1分ほど）、このincubatorがコンタミしているのでは？と思い、そのプレート3枚を取り出し、ビニール袋に入れて（密封ではないですが、エアレーションは悪いと思います）別のincubatorに入れました。 先ほど結果を見たところ、100 mm dishのプレートの辺縁にのみこれまで見て来たコンタミらしきものが生えており、比較的中央のエリア（大体 直径2 cmほど) は汚染されておらず、目的の大腸菌と思われるコロニーをいくつか拾うことができました。これが本当の大腸菌かはわかりませんが、明日ミニプレップしてみます。 ちなみにプレートのフタを取りコロニーをピックアップする際、独特の臭いがしました。 酵母でしょうか？ エアレーションの悪い中央部のみ大腸菌が生えたという事は、このコンタミは好気性だと考えるのはまだ早いでしょうか。プレート三枚とも中央部のみコンタミが見られませんでした。

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