BioTechnicalフォーラム [長いPCR産物のシーケンシングを受託する業者]

長いPCR産物のシーケンシングを受託する業者

No.3624-TOPIC - 2014/12/03 (水) 11:58:15 - ひらいた

現在、ある生物のミトコンドリアDNAをlong PCRして、
その配列を読む、という実験作業をしています。

long PCRといっても5000bpより小さいものがほとんどですが、
これを業者に発注してシーケンシングしてもらっても
700bpほどしか読めないので、

　　シーケンシング発注
　　-> 配列データが帰ってくる
　　-> プライマーを作成・発注
　　-> シーケンシング発注

を何回か繰り返す必要があります。

プライマーにも料金がかかりますし、
時間もかかってしまいます。

もし、long PCR産物の全長シーケンシングを
低価格で受けてくれる業者があれば
利用したいと考えているのですが、
どなたかご存じないでしょうか？
　

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No.3624-8 - 2014/12/04 (木) 12:56:43 - ひらいた

>Gel さま

業者を教えていただき、ありがとうございます。
ただどこの業者も、劇的に安い、というわけにはいかないようですね...

>mon さま

保存的な領域でプライマーは作成してはいるのですが、
それでも長過ぎて読み切れない領域が残る状態でした。

transposon-tagging法について教えていただきありがとうございます。
shotgun法のように、断片化してクローニングすることも
考えてみようと思います。

(無題)

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No.3624-7 - 2014/12/03 (水) 14:19:18 - AP

プライマーウォーキング（ウォーク）・シークエンスというやつですね。
それで検索するとプロバイダが幾つか見つかりますが、安くはないなあ。

(無題)

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No.3624-6 - 2014/12/03 (水) 13:23:40 - おお

全長を読んでくださいという丸投げのサービスもあるとおもうけどなぁ。。。値段はどうだろう。。。

(無題)

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No.3624-5 - 2014/12/03 (水) 13:06:25 - mon

保存性の高い部位を選んで、何本か内部プライマーを設計して、一気にシークエンスをお願いするのではダメですか？
注意点は、あるプライマーがアニールする配列も他のプライマーで読めるように設計することです。
もし変異があっても内部プライマーの3'側ならシークエンスは読めると思います。
読めなかったときに新たにプライマーを追加する必要がありますけど。
シークエンスするPCR産物が多くなれば、クローニングして、
deletion mutantの作成あるいはtransposon-taggingする方法もあります。
あるいはランダムに断片化したものをショットガンクローンをいくつか読むか。
この辺はヒトゲノムプロジェクトが始まる前～黎明期に開発された方法で、成書も多いです。
transposon-taggingのkitが販売されていますが、原理は薬剤耐性遺伝子の入ったtransposonをplasmidにランダムに挿入し、transposon配列内のプライマーと、ベクタープライマーでシークエンスする方法です。
PCR等で適切なクローンを選ばないとシークエンスの無駄が多いですが、数打てば全長が読めるという方法で贅沢だけど手間は少ない方法です。

(無題)

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No.3624-4 - 2014/12/03 (水) 13:03:11 - Gel

というか、プライマー発注までしなくても、追加解析サービスをしていて解析後何日以内にプライマー配列を指定すれば追加解析しますってサービスもあると思いますが。一度相談してみては？

(無題)

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No.3624-3 - 2014/12/03 (水) 12:57:38 - Gel

あとはここ
旧オペロン

https://eurofinsgenomics.jp/jp/service/dnasequence/pricelist.aspx

(無題)

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No.3624-2 - 2014/12/03 (水) 12:55:31 - Gel

ホクシス

http://www.hssnet.co.jp/2/2_3_1_2.html#2