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マウス膵臓からの免疫細胞の採取について トピック削除
No.3655-TOPIC - 2014/12/12 (金) 13:44:30 - べーと
マウス膵臓から免疫細胞を採取しようとしているのですがうまくいきません。
現在行っている方法は以下の通りです（論文を参考にして行っています）

１.マウスにエーテルで深麻酔をかけ、反応が無くなった後に切開する
２.心灌流を行い血液を除去した後膵臓を採取し細かく刻む
　（PBS中で脂肪を除去する）
３．コラゲネース処理 37℃ 40min
　 （参考にした論文ではヒアルロニダーゼとDNaseも加えていますが、
　　 ヒアルロニダーゼはラボになく、DNaseは今後の実験操作においては不要　　 と考え入れていません）
４．組織をスライドガラスを用いすり潰す
５．70umフィルターを通し、培地でWashする
６．CD45陽性細胞をマグネットビーズを用いソートする

以上です。
実際にこの操作を行いセルカウントを行ったのですが、ソート前、ソート後ポジネガのどのフラクションでも細胞が全く確認されませんでした。

やはりヒアルロニダーゼを入れなかったことが影響しているのでしょうか？
（4の段階で組織片がかなりねばついており、フィルターも上手く通りませんで　した）
そもそもこの方法は一般的なものなのでしょうか？

膵臓を扱ったのは初めてでまだまだ試行錯誤の段階です。ご教授の程どうぞよろしくお願い致します。
　
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(無題) 削除/引用
No.3655-4 - 2014/12/12 (金) 18:49:01 - べーと
ご助言ありがとうございます。

HIHさん
なるほど、そのステップで細胞をロスしていたのですね。
200ml…かなりの量ですね。それをシリンジで処理するとなると大変そうですね。
がんばってトライしてみます。

おおさん
すみません。その時はなんとなく後々のRNA抽出のためかなくらいに考えていました。それはそれこれはこれで、普通に考えて死細胞からのDNA処理ですよね。抜けてました。

加えてお尋ねしたいのですが、粘性が出るのはDNAももちろん関与すると思いますが、先にあげたヒアルロニダーゼの方はどうお考えでしょうか。一般的には使用しないものなのでしょうか。

(無題) 削除/引用
No.3655-3 - 2014/12/12 (金) 18:22:52 - おお
>[Re:1] べーとさんは書きました :

> ３．コラゲネース処理 37℃ 40min
> 　 （参考にした論文ではヒアルロニダーゼとDNaseも加えていますが、
> 　　 ヒアルロニダーゼはラボになく、DNaseは今後の実験操作においては不要

といいますか、後のステップで粘性が出るのを防ぐために入れているんだとおもいます。粘性がでるのは死んだ細胞のDNAだといわれていますから。そのほかにDNaseをいれる理由があるんでしょうか。

(無題) 削除/引用
No.3655-2 - 2014/12/12 (金) 17:16:06 - HIH
膵臓からの細胞採取はかなり難しいと思いますが、気づいた点をひとつ。

＞4の段階で組織片がかなりねばついており、フィルターも上手く通りません

とのことですが、この手の組織処理後に液の粘性が高くフィルターが通らないケースはその時点でほぼすべての細胞をロスします。

私の経験上おすすめの方法はコラゲナーゼ処理後の細胞懸濁液をPBS200mlくらいでものすごく薄めて18Gのシリンジでピペッティングすることで組織を完全にほぐす過程を加えることです。細胞にダメージを与えないように力加減は必要ですが。
これですんなりフィルタに通るようなら細胞が確認できると思います。

また、膵臓だと死細胞などが多いのかもしれないのでどうしても粘性が高い場合はやはりDNaseを入れる方が良いのかもしれませんね。

マウス膵臓からの免疫細胞の採取について 削除/引用
No.3655-1 - 2014/12/12 (金) 13:44:30 - べーと
マウス膵臓から免疫細胞を採取しようとしているのですがうまくいきません。
現在行っている方法は以下の通りです（論文を参考にして行っています）

１.マウスにエーテルで深麻酔をかけ、反応が無くなった後に切開する
２.心灌流を行い血液を除去した後膵臓を採取し細かく刻む
　（PBS中で脂肪を除去する）
３．コラゲネース処理 37℃ 40min
　 （参考にした論文ではヒアルロニダーゼとDNaseも加えていますが、
　　 ヒアルロニダーゼはラボになく、DNaseは今後の実験操作においては不要　　 と考え入れていません）
４．組織をスライドガラスを用いすり潰す
５．70umフィルターを通し、培地でWashする
６．CD45陽性細胞をマグネットビーズを用いソートする

以上です。
実際にこの操作を行いセルカウントを行ったのですが、ソート前、ソート後ポジネガのどのフラクションでも細胞が全く確認されませんでした。

やはりヒアルロニダーゼを入れなかったことが影響しているのでしょうか？
（4の段階で組織片がかなりねばついており、フィルターも上手く通りませんで　した）
そもそもこの方法は一般的なものなのでしょうか？

膵臓を扱ったのは初めてでまだまだ試行錯誤の段階です。ご教授の程どうぞよろしくお願い致します。
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