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(無題) 削除/引用 No.3662-22 - 2015/01/04 (日) 13:59:53 - おお エレクトロポレーションは効率がいいとは思いますがほかの試薬はどうでしょうか。lipofectaminとかfugeneとか。細胞さえへたらなかったら、試薬のはいった培地でずっとかいつづけられますし。 その不死化血球細胞以外にavailableな細胞はありませんでしょうか。もしかしたらSV40 largeT antigenで不死化した細胞があるかもしれません。 おもいきって、SV40 largeT antigenの発現ベクターをcotransfectionしてみるとかどうでしょうか。 ベストの時間はやはり入れたものによって違いますので、やってみないとわからないと思います。ただ全く発現が観察されなかったものが、ちょっと時間をずらして、バッチリの発現量は期待できるかどうか、、、 pcDNA3.1+とおっしゃっていたようにおもいますが、stableをとってみる手はあるかもです。

(無題) 削除/引用 No.3662-21 - 2015/01/03 (土) 14:59:38 - MTN おおさま あけましておめでとうございます。 返信が遅れてしまい大変申し訳ありません。 時間が経ってしまいましたので再度問題を提示させてください。 問題: 構築したプラスミドから、293TやCHOでタンパク質の発現が確認されるのですが、不死化血球細胞では発現が全く確認されない。 -> 293TやCHOへはPEIで遺伝子導入を行い、pEGFP-N1の導入による効率を見積もると90%で導入が確認され、構築したプラスミドを導入した際にはwestern blottingにより目的のタンパク質の発現がtag抗体により強く確認される。 -> 血球細胞へはエレクトロポレーションで導入を行い、pEGFP-N1（4.7 kb）の導入により80%を越える細胞でGFPが陽性となる。一方、目的のプラスミド（10 kb）を導入した際にはwestern blottingでは全く（filmへはover exposeしました）検出されない。 年度から年始にかけ、制限酵素で切断したプラスミドをエレクトロポレーションしましたが、やはり発現が全く確認されませんでした。 行ったこととして、 1. MG132（final: 10 uM）を細胞を回収する6時間前に処理しても発現が確認されない。 目的のタンパク質には２つ（HisとV5）tagが付いていますが、V5抗体に変えてanti-Hisに比べ特異性をあげても検出させませんでした。 2. pEGFP-N1 15 ugに対して、モル濃度を揃え、30 ug（50 ugも試しました）で目的のプラスミドを導入してみましたが、目的のタンパク質は確認されませんでした。 今のところ目的のタンパク質を期待通り発現してくれるのは293TとCHOのみです。 細胞を回収する時間は48-60時間目です。 そこで質問させていただきたいのですが、ある時点におけるタンパク質の量は、発現量と分解量のバランスによるとは思いますが、前者の発現量というのはどのあたりがmaxになるのでしょうか？ 今、12, 24, 36時間で細胞を回収してみてみようと思っています。 早期に細胞を回収することで目的のタンパク質の発現が確認されるようになったという経験お持ちの方いらっしゃいますでしょうか？ 中々問題が解決されず、情けないですが、コメントいただけるようでしたらどうかよろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.3662-20 - 2014/12/15 (月) 15:55:59 - おお スーパーコイルになっているので意外ときらない方がコンパクトになっているかもという感触はあります。

(無題) 削除/引用 No.3662-19 - 2014/12/15 (月) 15:52:53 - おお >[Re:18] MTNさんは書きました : > > おお様 > エレポの場合にはプラスミドを線状にした方が膜を通りやすい、ということはないのでしょうか・・ややプラスミドの大きさが気になります。。 homologous recombinationでは大きいベクターを扱いますのでまあプラスミドのレンジの大きさでどうこうということはないようなきがします。 ESなどで線状にする理由の一つは入るコピーナンバーのコントロールがしやすいときいたことがあります(そのソースとか定かでないので正しいかどうかわかりません)。つまり環状でいれると1copy入れたくて量を減らしても入った細胞には数コピーはいったりとかそんなことをそうぞうしています。ということは細胞内にはうまく入っているっていうことですよね。くわえて直鎖上の方がintegrationに有利なばあいがあります。 ただそう言う話はきいているもののプラクティカルにはあまり経験はないですので、改善のためにいろいろやるついでに直さ状のものも一つ加えて一度やってみてはどうでしょうか。直さだとexoのnucleaseによって削られやすいような気がしますので、減弱が早いとかないかなと漠然とおもいますけど、、、 きった場合末端の状態はどうするべきかについては、特にこうあるべきだというのはきいたことはありません。ESでそうしている発表などを参考にされるといいかと。おそらくきってそのまま入れてるだろうと思います。amp耐性のプラスミドだとScaIとかXmnIがamp上にあり発現ユニットと関係ないところなのでユニークであればあまり考えずにその辺りできってもいいかもです。あと大腸菌用oriあたりにあるやつかなAttIだっけ。ま、バックボーンによって違いがありますのでマップを確認された方がいいですけど。

(無題) 削除/引用 No.3662-18 - 2014/12/15 (月) 14:48:30 - MTN 皆様誠にありがとうございます。 GFP様 Hisタグがworkしないことを想定して、V5をタンデムに付けていますのでそちらでも検出を検討してみます。 dd様 GFP以外のコンストラクトは蛍光を持っていませんが、それらのGFPの蛍光はゼロです。FACSのFSC/SSCでもdead cellsをexclusionしています。 おお様 確かに抗His抗体でHEK, CHO、血球細胞を染めると必ず太いbandが3本、それからminorなbandがいくつか見えます。ただ、私の興味あるタンパク質の分子量は130, 90 kDaですので、GFP単独を導入したHEKやCHOにおいてはそこの分子量にはbandを認めませんが、目的のタンパク質を発現すると、1 minのfilmへのexposureでガツンとbandが検出されます。ただ、、、血球系細胞にそれを発現させると、over nightでfilmにexposureさせても全くbandは見られません。下の方のいつも見える3本のbandは当然めちゃくちゃ太くbandが出ていますが… 20%ほどGFPを入れて、目的の遺伝子を導入してみます。 エレポの場合にはプラスミドを線状にした方が膜を通りやすい、ということはないのでしょうか・・ややプラスミドの大きさが気になります。。

(無題) 削除/引用 No.3662-17 - 2014/12/15 (月) 13:52:16 - おお >[Re:13] MTNさんは書きました : > おお様 > GFPとのco-transfectionはぜひ行ってみる事にします。大体目的の遺伝子のモル比で10%もあれば大丈夫でしょうか。 効率をみつもるのにだいたい5-20%ぐらい混ぜることがおおいです。もともとそんなによくないなら条件模索とわりきって1:1でもいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3662-16 - 2014/12/15 (月) 13:22:11 - おお His-tagの抗体は経験した範囲では、特異性と感度はそんなによくないんだよな、、、非常に強く発現した場合はうまくworkすることも歩けど。とくにまんまるの細胞にはpolyHisの蛋白がおおくコードされているので特異性がたかくても、なにがしかのタンパク質を検出してしまう。

(無題) 削除/引用 No.3662-15 - 2014/12/15 (月) 12:17:56 - dd エレクトロポレーションは細胞障害性が高いですが、GFPの蛍光が自家蛍光ではないことは確認してますよね？ ベクターのプロモーターやバックボーンが発現に影響することもあるので、pEGFP-N1が発現できているなら、そちらに組換えてみてもいいかと思います。

(無題) 削除/引用 No.3662-14 - 2014/12/15 (月) 11:41:35 - GFP 293Tでエレクトロポレーションしてみて、pEGFPでのGFP intensityと、そのプラスミドでのウエスタンで一致した結果が出れば、エレクトロポレーションそのものは大丈夫（少なくとも293Tでは）と結論できるので、やってみる価値はあると思います。 293TにHis-tagのついたタンパクをPEIで過剰発現して、抗His-tag抗体でウエスタンをやったところ、結構ノンスペが出て困った事があります（どこの抗体だったかもう記憶が無いのですが）。結局その時はタンパク自体に対する抗体がワークしたので切り替えました。もし293Tでのエレクトロポレーションに問題がなければ、tagをFLAGなどに変えるか、タンパクそのものを検出する抗体を試すのも、手かもしれません。 遠い昔、ES細胞でエレクトロポレーションをやってましたが、その時は平滑末端でリニアにしてました。当時は実験初心者で、プロトコールをただなぞっていただけなので、細かい事はあまり覚えてないのですが、当時はどう頑張っても80%入る事はあり得なかったです。最近のエレクトロポレーションの導入効率には驚かされました。

(無題) 削除/引用 No.3662-13 - 2014/12/15 (月) 10:33:33 - MTN おお様 GFPとのco-transfectionはぜひ行ってみる事にします。大体目的の遺伝子のモル比で10%もあれば大丈夫でしょうか。 293TやCHOでの結果と、造血系細胞での結果が乖離しているようですが、293TやCHOでの発現もエレクトロポレーションでの結果でしょうか？　また、GFPのintensityは定量的に解析した結果（FACSなど）でしょうか？　 GFP様 >GFPの場合、293Tと造血系細胞で導入効率が同様に80%との事ですが、293Tでの過剰発現の場合、発現量が相当高くなる場合が多い気がします（ベクターにもよるとは思いますが）。 はい。確かにpcDNA3.1+ですので、SV40oriを持つHEK293T（導入効率80%）は、CHO（導入効率30%）に比べかなり強く発現します。ですが、CHOでさえも、1 minもexposeすればanti-Hisx6タグ抗体で容易に検出できるようになりますので、検出感度は良いと思っていました。 >ウイルスでGFP発現した場合、293TではFACSで振り切れてしまう（10の5乗）感染条件でも、造血系細胞では10の3乗と4乗の間くらいにピークが来るケースがあります。 経験に基づく興味深いご指摘をいただきありがとうございます。そうなんですね。非常に驚きました。 GFPのintensityや導入効率はFACSを用いています。 タグはHisx6タグのもので、abcamから購入したものです。検出感度はCHO mutant（GFPの導入効率10数%）に導入した際にも容易に目的のタンパク質をWBで検出することができています。 問題は、血球系細胞でなぜその目的のタンパク質が発現しないのか、そこが私が抱える問題です。 ベクターサイズの大きさを疑い、約1 kb短くした欠失変異体(ベクターサイズ9 kb)をHEK293TやCHOにtransfectionするとWTのタンパク質に比べ報告通りかなり効率的な発現が確認されました。 しかし、血球系細胞へのエレポでは、この欠失変異体（9 kb）でさえも全く目的のタンパク質が確認されませんでした。 ＊HEK293TやCHO, CHO mutantへの導入はPolyethylene Imineを用いています。 調べたところによると、このPEIはリソソームを破裂する作用があるようです。 もしかしたら、Polyethylene Imineで導入した細胞ではリソソーム障害によりよりタンパク質や導入したプラスミドが安定に働くのかもしれません。 エレポでは膜に穴をあけるだけですので、導入されたプラスミドやそこから発現したタンパク質が分解されてしまうのかもしれないと今考えています。 例えばリソソーム阻害作用のあるクロロキンや、プロテアソーム阻害剤のラクタシスチンやMG132処理によりタンパク質の検出が可能になるのではと現在考えています。ですが、根拠は何もありません。 HEK293Tでエレポをしてみて、目的のタンパク質が検出されるかを見てみるというのも手かもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.3662-12 - 2014/12/15 (月) 10:14:21 - GFP 293TやCHOでの結果と、造血系細胞での結果が乖離しているようですが、293TやCHOでの発現もエレクトロポレーションでの結果でしょうか？　また、GFPのintensityは定量的に解析した結果（FACSなど）でしょうか？　 GFPの場合、293Tと造血系細胞で導入効率が同様に80%との事ですが、293Tでの過剰発現の場合、発現量が相当高くなる場合が多い気がします（ベクターにもよるとは思いますが）。 ウイルスでGFP発現した場合、293TではFACSで振り切れてしまう（10の5乗）感染条件でも、造血系細胞では10の3乗と4乗の間くらいにピークが来るケースがあります。293Tと比べて造血細胞では1/20から1/50程度の発現量に相当します。蛍光顕微鏡では、GFP導入293Tと造血細胞を一緒に見ないと、顕微鏡の条件が違っていたりしてintensityの差をきちんと評価できてないかもしれません。 私の場合、造血細胞ではウイルスしか使ってないので、エレクトロポレーションでも当てはまるかどうかはわかりませんが、もしGFP intensityを定量的に評価していないのであれば、一回定量的な方法で見ておいてもいいかもしれません。 あと、ウエスタンの抗体ですが、比較的発現量が低くても十分検出できるものなのでしょうか？　タグと抗体が分かると検出系の問題の可能性についても議論しやすくなると思います。

(無題) 削除/引用 No.3662-11 - 2014/12/14 (日) 21:40:52 - おお たとえば目的のプラスミド12ugとEGFPのベクタ3ugを混ぜてtransfectionしたら、導入効率を見ることができるので解決策が見えてくるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3662-10 - 2014/12/14 (日) 18:47:10 - MTN >[Re:9] モモさんは書きました : > 導入した遺伝子の血球細胞での発現量は293TやCHOでの発現量よりずっと低いのが普通なので、血球細胞でウエスタンでは見れないのは普通だと思います。 GFPのintensity自体はHEK293TやCHOと遜色無く血球系では染まりましたので発現量は同程度あると期待していました。モモ様の仰られるように必要があればmRNAの発現量を見て行かねばなりませんね。 とすると感度をいつも以上にあげなければなりませんね。

(無題) 削除/引用 No.3662-9 - 2014/12/14 (日) 17:56:09 - モモ 導入した遺伝子の血球細胞での発現量は293TやCHOでの発現量よりずっと低いのが普通なので、血球細胞でウエスタンでは見れないのは普通だと思います。

(無題) 削除/引用 No.3662-8 - 2014/12/14 (日) 17:16:25 - MTN mon様、ご返信ありがとうございます。 エレクトロポレーションを行った後のtime constantはほぼGFPのものと一緒でした。 きちんとしたtime constantの値はノートに記載しているのですが、数%の違い程度と記憶しています。電気容量は固定しているので、抵抗値もさほど変わらないと思っています。 確かに出来るだけプラスミドの溶液のvolumeを減らす努力は必要そうです。気付かせてくださりありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.3662-7 - 2014/12/14 (日) 17:10:49 - MTN モモさん、ご返信ありがとうございます。 HEK293T（GFPでの導入効率80%強）やCHO細胞（GFPでの導入効率30%）に発現すると効率よく検出されるんです。当然、血球系細胞でGFPが80%強でたので、容易に検出されるものと期待していたのですが、オーバーナイトでfilmに焼き付けてもいつも見えるノンスペのバンドは出るのですが、目的のバンドが見えませんでした。

(無題) 削除/引用 No.3662-6 - 2014/12/14 (日) 17:01:03 - mon pEGFP-N1 (4.7 kb, 2 mg/ml) 15 ug＝7.5uLと目的のプラスミド(10 kbと9 kb, 0.5 mg/ml)15 ug=30uL に200uL Bufferを加えるでは、かなり電気抵抗が変わりそうです。 DNA液量を30uLにしたpEGFP-N1を導入したときの効率はどれくらいでしょう？ 最近の機器は知らないのですが、エレクトロポレーションの至適条件はとても狭いと感じているので気になるところです。

(無題) 削除/引用 No.3662-5 - 2014/12/14 (日) 16:54:21 - モモ 目的の遺伝子の検出系の効率が低いだけでは？

(無題) 削除/引用 No.3662-4 - 2014/12/14 (日) 16:15:10 - MTN ご返信ありがとうございます。 >一過的なトランスフェクションではなく、相同組換えによるターゲティングか、導入遺伝子が染色体にインテグレートされたstable lineをつくるためでしょう。 ということはエレクトロポレーションに限ったことではないということでしょうか。 リニアの方がエレクトロポレーションで生じたporeを通過しやすいのかと当初想像しました。 >プラスミドの量をサイズが大きくなる場合には増やしているようです。分子数を一定にするためでしょう。 分子数を一定にするため、ということで納得はできるのですが、GFPの5 kbのベクター15 ugで80%以上導入される一方で、10 kbのベクター15 ugで発現が全く見られないので私が抱える問題は別のところにありそうです。線状にしてもベクターの量を2-3倍にしても発現は見られないかもしれませんね。 一度検討はしてみます。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.3662-3 - 2014/12/14 (日) 10:12:00 - AP >プラスミドを制限酵素でリニアライズしておく 一過的なトランスフェクションではなく、相同組換えによるターゲティングか、 導入遺伝子が染色体にインテグレートされたstable lineをつくるためでしょう。 >プラスミドの量をサイズが大きくなる場合には増やしているようです。 分子数を一定にするためでしょう。 ということで、驚きはないです。

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