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(無題) 削除/引用 No.3665-8 - 2014/12/18 (木) 14:46:22 - むらいー おお様、ありがとうございます。 SDS2％バッファーで可溶化を行ってみます。 もしそれでもバンドが出なさそうであれば、いただいたアドバイスを参考にサンプルを作り直すことも検討したいと思います。 皆様ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3665-7 - 2014/12/16 (火) 18:14:08 - おお 熱変性で沈殿した大部分の蛋白は強力な変性剤を使えば可溶化できるでしょう。SDSが1-2%入ったバッファーやfinal 4M以上(できれば6M以上)の尿素を使えば濃度さえ間違えなければ可溶画分にほぼ回収できるのではとおもいます。ただ、個々の蛋白にしぼっていうと、そうでないものもある可能性があります。 尿素にとかしたあとは過熱ができないので(carbamylationが起ってよくないらしい)注意が必要です。長期保存でももしかしたらよくないかもしれませんが、詳しくはわかりません。

(無題) 削除/引用 No.3665-6 - 2014/12/16 (火) 14:33:36 - むらいー おお様、独り言様、ありがとうございます。 確かに8mg/mlは濃すぎるかもと思っていたので、それが原因かと考えてはいたのですが、可溶化できてもSDSがつくつかないという問題があったのですね…。次回はバッファーを多めにして行ってみます。 独り言様がおっしゃられているように、ボイルも37℃か55℃でやってみます。 思えばボイルした後、1,2本のサンプルで沈殿しているものがありました。上澄み採取の時に誤って沈殿物を吸っただけだと思っていましたが、あれは熱変性によるものだったかもしれません。 自分の知識不足による失敗ばかりでお恥ずかしいのですが、濃度を測定する前にボイルまで行っており、そのようなサンプルが50近くあります(多少作成方法が違うのですが)。SDSやボイルによる失敗ならば、やはりここからバンドがでるサンプルに変化(再利用？)させるのは厳しいでしょうか。 少し前に、単に濃度が濃すぎるからだと思い、ボイル後にRIPAで希釈したり、ピペッティングで泡立ててさらにボイルしたりしたのですが、熱変性を起こしたサンプルは論外だとして、他のサンプルに対しても意味のないことだったのでしょうか。 恥を重ねるようですが、ご教授頂けたら幸いです。

(無題) 削除/引用 No.3665-5 - 2014/12/15 (月) 19:26:10 - 独り言 ボイリングなしに一票。 条件はタンパク質によると思うので、サンプルバッファー加えて55度とか３７度で５分とか室温オーバーナイトとか試してみるといいと思う。

(無題) 削除/引用 No.3665-4 - 2014/12/15 (月) 13:14:24 - おお >[Re:3] むらいーさんは書きました : > おお様、ご返信ありがとうございます。 > > 情報が欠如しており申し訳ありません。 > 結果としては、150kDa(NMDA)や50kDa(Tublin)のバンドが検出されるはずが、250kDaのところで太くて雑なバンドが出ています。 > 泳動後のゲル確認を機器で観察していますが、検出感度とコントラスを上げるとうっすら流れていることがわかる、程度でした。 > 分子量マーカー、ポジコンはきちんと流れています。 > なので、可溶化がきちんとできなかったのでは…と考えています。 > > 使用した脳組織はマウス大脳皮質左右分300μl-500μl(だと思います)で、懸濁には2-3mlを用いています。6サンプル作成して、大体どれもタンパク濃度は8mg/ml前後です。希釈にはRIPAを用いています。 8mg/mlはちょっと濃すぎるのでは。可溶化ができてない心配もありますが、可溶化されていてもSDSの量が追いつかないかもしれません。蛋白1gにたいして1.4-1.7gのSDSがつくという話をききます。蛋白1gにたいして2g必要と考えれば、、、ぎりぎりですか、、、ただ膜やそのほかにもSDSがつきますから。あと蛋白が濃いいといくら十分なdetergentがあってもボイルで明らかな熱変性による沈殿が見られることがあります。 こいいとover loadになってないかも考えて見るべきだと思います。loading の量は10ugで十分だと思います(ゲルの暑さやコームの太さなどいろいろ要因がありますので一概にいえませんが)。 まずは上記のことを改善して、とくにtubulin (tubulinはスタンダードなプロとコールでたいていうまくいくので) などがきれいに流れてバンドが得られる条件で、NMDAが検出できるかみてみてはどうでしょうか。それでも挙動がおかしいなら、たまにある膜蛋白のアグリゲーションがおきている可能性もあるのでboilingをさけるとかさらなる工夫をするようにしたらいいかと思います。

(無題) 削除/引用 No.3665-3 - 2014/12/15 (月) 12:27:02 - むらいー おお様、ご返信ありがとうございます。 情報が欠如しており申し訳ありません。 結果としては、150kDa(NMDA)や50kDa(Tublin)のバンドが検出されるはずが、250kDaのところで太くて雑なバンドが出ています。 泳動後のゲル確認を機器で観察していますが、検出感度とコントラスを上げるとうっすら流れていることがわかる、程度でした。 分子量マーカー、ポジコンはきちんと流れています。 なので、可溶化がきちんとできなかったのでは…と考えています。 使用した脳組織はマウス大脳皮質左右分300μl-500μl(だと思います)で、懸濁には2-3mlを用いています。6サンプル作成して、大体どれもタンパク濃度は8mg/ml前後です。希釈にはRIPAを用いています。 loading controlはとっておらず、市販のポジコンのみです。 他に足りない情報はありますでしょうか。 宜しくお願い致します。 おお様、sample bufferを入れて極端に温度を上げないというのは、室温でovernight(どこかで見た気がします)ということでしょうか。Ureaについて調べてみます。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.3665-2 - 2014/12/15 (月) 05:32:30 - おお で結果はどんな感じだったんでしょか? 期待しているところにバンドは出ないが、そのほかのところにバンドが出るとか、全くバンドがでないとか、、、 組織どれくらいを使って、どれくらいのボリュームのバッファーにけんだくしたのですか? そのときの蛋白濃度はどれくらいでしたか? なにかloading controlはとってますか?それはうまく検出できましたか? 表面上無難な方法でありますが、いろいろと落とし穴がありますので上記のようにもう少し情報があった方が、レスがつきやすいのではとおもいます。 膜蛋白はボイリングであぐってうまく検出できないことがあるようですが、sample bufferをいれて温度を極端にあげないとか、Ureaを使う(ureaを使うとやはりぼいるできませんが)などの解決方法が昔のとぴで議論されています。

マウス脳からのNMDAタンパク抽出、WB 削除/引用 No.3665-1 - 2014/12/14 (日) 22:06:10 - むらいー いつも勉強させていただいております。 マウスの大脳皮質からタンパクを抽出して、NMDA受容体をWBで検出したいと考えておりますが、難航しています。 試行錯誤の中、サンプル作成に問題があったのではないかと思います。 以下の方法でおかしい、間違った箇所はありますでしょうか。 新しくWBを立ち上げて色々と調整しているところであります。 どうか初心者にもわかりやすいご回答いただけたらと思います。 よろしくお願い致します。 1.マウスから大脳皮質を採取。 2.RIPAバッファー、PKインヒビター、SDS(final0.1%)を加えてホムジナイズ、超音波破砕を各10秒。 3.10000rpm,5minで上澄みを採取。 4.4×ラメリ、2-ME(final2%)を加えて100℃,10minボイル。-20℃で保存。

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