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(無題) 削除/引用 No.3677-13 - 2014/12/19 (金) 11:21:05 - おお 35サイクルぐらいまでにCtが得られないなら検出限界以下とすることはまあまああるようです。場合によっては40-45サイクルまで持っていく人もあるようですが、非常に理想状態にちかい条件でないと難しいかもしれません。なのでqPCRでどの辺りで立ち上がるか一度見てみてもいいかと思います。それでどうしても多めにサイクルを回したいなら、PCR条件を若干厳しくしてそれであまり効率が損なわれず、40サイクルまでで立ち上がらないなら、それでよしとしてもいいかもしれません。 今の条件では40サイクルでバンドが見えてるので40サイクルより低いところですでに立ち上がってますよね。

(無題) 削除/引用 No.3677-12 - 2014/12/19 (金) 08:13:44 - pp ampliconのサイズが書いてませんが、プライマーダイマーの可能性はないのでしょうか。 出たり出なかったりと書いてあるので、qPCRで融解曲線が1ピークだったとしてもそのときたまたま出てなかったのかもしれませんし。 シークエンスで確認するのが確実だと思いますが。

(無題) 削除/引用 No.3677-11 - 2014/12/18 (木) 17:37:10 - コンタミマン >>おお　様 コンタミチェックのためのPCR条件を一応すべて載せておきます。 95度　5 min 95度　10 sec* 58度　10 sec* 72度　10 sec* 16度　-- *印を40サイクル 2xGoTaq Green Master Mix を10 ulの系で使用 Primer 0.2 uM（最終） Template 1 ul （RT産物を水で5倍希釈したもの） 40サイクル後、3% Agarose/TBE　で泳動してます。 non-RTで出てくるバンドの感じとしてはRTより圧倒的に弱いです。 遺伝子によっては露光条件次第で見逃しそうなくらいのものもあります。

(無題) 削除/引用 No.3677-9 - 2014/12/18 (木) 17:14:30 - おお あと、サイクル数は、、、

(無題) 削除/引用 No.3677-8 - 2014/12/18 (木) 16:09:43 - コンタミマン >>おお　様 >>追加情報ありがとうございました。ではノンすぺなのかもしれません。 >>その-RTのバンドの配列はシーケンスできますか? もしPCR産物やプラスミドのコンタミなら可能です。サブクローニングの際のプライマーを使えるはずですから。 >>サイズはポジと全く同じ場所に来ますか?ゲルはあがロースですか?あがロースのばあいPAGEでながすとどうですか? 　サイズはポジと同じ場所に来ますが、アガロースゲルですので正確なことはわからない状態です。 　PAGEはまだやっていないです。 さらに後出しで申し訳ないのですが…… 条件検討の際に別の個体を使ってやったことがあるのですが、その時は同条件でnonRTにバンドを認めなかったこと 試しにやったqPCRでは融解曲線が均一になっていたこと も付け加えます。 DNaseが古い（2009年開封）のは相当まずいでしょうか・・・

(無題) 削除/引用 No.3677-7 - 2014/12/18 (木) 15:59:22 - おお 追加情報ありがとうございました。ではノンすぺなのかもしれません。その-RTのバンドの配列はシーケンスできますか?サイズはポジと全く同じ場所に来ますか?ゲルはあがロースですか?あがロースのばあいPAGEでながすとどうですか?

文字化け訂正 削除/引用 No.3677-6 - 2014/12/18 (木) 14:49:20 - コンタミマン >>おお　様 そういうことでしたか。 in putしたRNAは400 ngで、10 ulでRT反応しています（40 ng/ul）。 それを5倍希釈し（この時点で8 ng/ul）、PCRにはそのうち1 ulを使っているのでかなり少なく、RNAの残りを電気泳動で検出しているとは考えにくいです

(無題) 削除/引用 No.3677-4 - 2014/12/18 (木) 14:35:24 - おお いやPCRは走らないでしょうけど分解したRNAフラグメントなど100bpあたりのサイズにきてもおかしくないのでin putのRNAゆらいのものをみてるかもと。

RNAの検出？ 削除/引用 No.3677-3 - 2014/12/18 (木) 14:30:32 - コンタミマン おお　様 >RNAが検出されてしまっているってことはないでしょうか。 それはつまり、non-RTのチューブ内にmRNAがインタクトな状態で残っていて mRNAを鋳型にして通常のPCRが走った、ということでしょうか？ だとしたら、そういったチェックは行えていない状態です。 むしろ初めて聞く現象で、どう対応すればいいか知識がありません。 RNaseH処理ということでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3677-2 - 2014/12/18 (木) 14:06:19 - おお RNAが検出されてしまっているってことはないでしょうか。

non-RT群で目的産物が出てしまう 削除/引用 No.3677-1 - 2014/12/18 (木) 13:16:32 - コンタミマン いつも参考にさせていただいております。 長くなるかもしれません。 散々論議されたことかもしれませんが、妙なことが起きているので書きこむ決意をしました。 前置きから。 現在、組織中での遺伝子の発現量をみる為、qPCRをやろうとしています。 cDNAを合成して、いざ、qPCRという前に普通のPCRでコンタミをチェックしていますが、non-RT群で目的産物が出てしまいます。 詳細な手順について以下に述べます。 ・6 つの遺伝子が対象。 ・プライマーはすべてイントロンを挟んでいる。 ・3 個体の組織をとり、別々に抽出している（3 チューブ分ということ） ・抽出法はTRIzol→DNase処理（TaKaRa）→TRIzolで再精製→グアニジンの残留があったらエタ沈で精製 （※DNaseが古いです。とっくに期限切れ） （※新しくプロメガのがほしいところ。バッファもCa++が入っていますし） （※DNase処理は20 U，70分） ・AMV（TaKaRa）で逆転写、水で希釈（五倍） ・PCR（プロメガGoTaq、40サイクル） 詳細な結果については以下。 ・水をテンプレートにしてPCR→バンドなし ・水をテンプレートに逆転写した産物→バンドなし ・水をDNase処理して精製、逆転写した産物→バンドなし ・non-RT群 　→遺伝子によってはバンドが出る（毎回同じ遺伝子、というわけではない）。 　→個体によってはバンドが出ない。 　→出てくるバンドはRT群に比べて薄い。 いままでとった対応は以下 ・逆転写用の溶液、PCR溶液を作る部屋を、電気泳動を行う部屋と別室、別ピペットマンに ・どうしても電気泳動を行う部屋で何かするときはバリアチップを使う ・PCRの際のアプライには8連ピペッターでクロスコンタミを防ぐ ・手袋、マスクの着用 ・qPCRのスタンダード用に作った大腸菌、プラスミドのコンタミ対策に、チューブ立てや机のハイター処理 　この条件下でさらにコンタミ対策をできるところなどあれば御教授いただけると非常に助かります。 　同じ処理をしているにもかかわらず遺伝子、個体によって出る出ない、というのが非常に不可解です。

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