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(無題) 削除/引用 No.3680-14 - 2015/01/02 (金) 23:45:20 - おお DNAだけで考えると凍結融解でそんなに変わらないとは思えるんですが、一回の凍結融解でCt値がどれだけ変わるもんなんでしょうか。。。 >３０枚のプレートに、先に、cDNA（1ul）やスタンダード（1ul）を入れておき、プレートにはシールをして、マイナス３０度で保存しておく。 この方法であれば一つの遺伝子にたいしては同じタイミングで融解するわけだし、ほかの遺伝子にかんしても融解するのは一回だし。 あと誤差の指摘はわかるんですが、どの程度の差をみたいかにもよるかもしれません。1ulの分注よりも、2-3ulぐらいの分注にすればより精度があがるかもしれません。 2、3日でやってしまうが確かにいいでしょうけど、やはりそればそれぞれのラボで事情もあるかもしれませんし、

(無題) 削除/引用 No.3680-13 - 2015/01/02 (金) 08:23:20 - protein 私だったらこんな実験の時はサンプルのcDNAを毎回凍結融解しないように4Cで保存して ２−３日で一気に実験してしまいます。

(無題) 削除/引用 No.3680-12 - 2014/12/21 (日) 19:41:24 - おお そういえば、DNAに結合しない蛍光色素をいれてピペッティングの誤差が補正できるっていうのがあったなぁ。。。

(無題) 削除/引用 No.3680-11 - 2014/12/21 (日) 19:10:55 - あつこ toyo様、重要な御意見をありがとうございます。 今回の目的は、サンプルごとの遺伝子間の発現量の差をみるよりも、 遺伝子ごとのサンプル間の発現量の差をみることを重視しております。 また遺伝子数が多いので、省力的に実施することを重視しています。 そのため、primer毎のmaster mixの調整の方針で考えています。 ピペット操作による持ち込みcDNA量の差は、統計解析において 誤差分散として扱うか、どうしても差を見極めたいほど、微妙で 重要な差がもし存在すれば、再度、デュプリで測定したいと考えて おります。

(無題) 削除/引用 No.3680-10 - 2014/12/20 (土) 15:18:14 - toyo 追加質問を読んで心配になったのですが、primerごとにマスターミックスを作る予定なのでしょうか? qPCRの際には、primerは過剰量入っているはずですので、primerを1uL取った時の精度が悪くても問題は生じないと思いますが、cDNAの分注精度は結果に直接影響します。 つまり、サンプル間でcDNAの濃度を正確に揃えることが大事だと思いますので、 primer毎ではなくて、cDNA毎にmaster mixを作ったほうが良いと習いました。 例えば、30種類分primerがあるならば、30+α well分のcDNA + buffer + 酵素 というマスターミックスを作って、30wellに分注し、後からprimerを各wellへ添加していくというような形です。 qPCRマシンがすぐに使えない時は、(hot start法を使っていたこともあり)数時間であれば4℃に遮光保存していましたが、マスターミックスの凍結保存は厳しいかもしれませんね。 4℃でどのくらいの時間安定に保存できるのか私は知りませんが、たとえばその日にqPCRにかけられそうな分だけマスターミックスを作成するなどしたほうがよいかもしれません。 cDNAサンプルを予め少量ずつ別のチューブに小分けしておくなど、凍結融解を最小限にすることは可能かと思います。 また、複数のプレートでのqPCRの結果を比較するのであれば、共通のcDNAサンプルを同じように凍結融解して同じprimerで増やすなど、なんらかのコントロールを置くと思います。 コントロールの結果から、サンプルがdegradationしていたか判断できるようなら、別の分注チューブに戻って正確に測定できるのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3680-8 - 2014/12/20 (土) 09:53:22 - あつこ すみません、追加で質問させてください。 通常、リアルタイムPCRでは、プライマーや水を添加したマスターミックスを調整してから、９６ウェルに分注（9ul）し、その直後に、cDNA（1ul）を入れています。 ３０遺伝子の定量を効率よく実施するため、またcDNAの凍結融解回数を減らしたいために次のようなことは可能でしょうか？ ３０枚のプレートに、先に、cDNA（1ul）やスタンダード（1ul）を入れておき、プレートにはシールをして、マイナス３０度で保存しておく。 リアルタイムPCRの実施の際には、プライマーや水を添加したマスターミックスを調整し、８チャンネルピペッタで、9ulずつ分注する。次にプレートシェーカーで攪拌し、プレート遠心機でスピンダウンする。そしてリアルタイムPCR装置にかける。 心配な点は、cDNA（1ul）のみをいれて、凍結保存していても大丈夫かという点です。クロスコンタミは、シール利用や使用するウェルの配置の工夫で予防したいと考えています。

(無題) 削除/引用 No.3680-7 - 2014/12/19 (金) 18:46:43 - あつこ さっそく、様々なご意見をありがとうございました。 ８チャンネルピペットの10ulを購入し、PCR用の96ウェルプレートをリザーバー代わりにし、クロスコンタミを避けるために、適宜、空白のウェルや、シールを用いることにします。

(無題) 削除/引用 No.3680-6 - 2014/12/19 (金) 07:49:38 - d すでに指摘ありますが、PP製のディープウェルプレートで良いと思います。 マスターミックスはあまり保存することはないので、ふたは必要なさそうです。

(無題) 削除/引用 No.3680-5 - 2014/12/19 (金) 07:02:00 - おお サンプルは96wellタイプの保存用プレートに保存するとよいかもです。ただ、クロスのコンタミがどの程度起こるかはちょっとわかりません。qRCRで経験がある方の意見をまちましょう。 あとは96well PCR tubeの端っこ8wellをリザーバーとして使う手はないですか?

(無題) 削除/引用 No.3680-4 - 2014/12/19 (金) 04:06:32 - 96ウェルプレート 質問をきちんと理解できません。ようするに、マスターミックス500ulを、96ウェルプレートに9ulずつ分注したいということでしょうか? これじゃ計算合わないな。 PCRを96ウェルプレートでやるということでしたら、1-200ulとか1-20ulとかのチップのラック(名称わからず)のチップが入る穴の位置が96ウェルプレートのウェルの位置に相当しますよ。でないとマルチチャネルピペット使えないですしね。チップの本数が、12x8で96本のっているのは、ちょうど96ウェルプレートの縦横のウェルの数と同じです。 私は、 1)マスターミックスを1.5mlのチューブに作る 2)氷の上においたチップのラックに、250ulチューブを8本差し込む 3)この8本に、マスターミックスを150ulずつとか分注する 4)マルチチャネルピペットを使って、PCR用の96ウェルプレートに9ulずつ分注していく でやっています。cDNAが入った500ulマイクロチューブも、チップのラックに差し込めるかもしれません。差し込めれば、これもマルチチャネルピペットを使って1ulx8ずつ取り出せるでしょう。 的外れな回答でしたらゴメンなさい。

(無題) 削除/引用 No.3680-2 - 2014/12/19 (金) 00:56:50 - おお ELISAで使うような平底かまる底の96wellプレートをリザーバーとして使えば?ELISA用やculture用は表面加工がしてあるだろうから、してないものを選ぶこと。また96wellの1列だけセパレートしたようなものもあるとおもう。通常のやつは250ulぐらいしか入らないけど、サンプルストック用とか深底のはもうちょっと入るかも。

多数のリアルタイムPCRを効率よく実施したい 削除/引用 No.3680-1 - 2014/12/18 (木) 23:44:20 - あつこ どうぞよろしくお願いします。 cDNAのサンプルが約４０あり、それぞれについてリアルタイムPCRで約３０遺伝子の定量をすることが必要になりました。 cDNAのサンプルは、濃度が20ng/ulで、500ulマイクロチューブに50ul入っています。リアルタイムPCRは、サイバーグリーン法で、96ウェルプレートを用い、１反応の総液量は10ul（そのうち1ulがcDNA）です。 新たにマルチチャンネルピペットの購入をすることは可能ですが、500ul程度のマスターミックス等をのせるために丁度よいリザーバーが見つかりません。また500ulマイクロチューブを、96ウェルプレートと同じ間隔で配置するラックというのも知りません。 このような状況でどのようにしたら、効率よく、反応液を調整して、リアルタイムPCR用プレートにロードすることができるでしょうか？

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