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(無題) 削除/引用 No.3694-11 - 2015/01/05 (月) 20:35:18 - RIN RNAのquality controlは泳動のデータを定量化する下記のsoftwareを用いました。 http://www.chem.agilent.com/Library/applications/5989-1165EN.pdf データの扱いについては、RIN scoreで9.0未満のサンプルを除外しdelta/delta Ctで解析しました。それでもある程度のバラツキは残ったのですが、複数のリファレンスが一定の傾向を示したので、標的の遺伝子についても同様の振る舞いをするとの仮定に基づいて解析しました。これで良いのかどうかは自信がありません。 培養細胞ではバラツキがほとんどなかったので、組織サンプルについても、酵素処理して短期培養（２日間）した後、死細胞を可能な限り除去した上でRNAを抽出したところ、バラツキはかなり改善されたので、この方法でのデータも合わせて解析しました。 組織からのRNAの定量については、nanodropとbioanalyzerで測定値にかなりぶれが出る事が分かり、最終的にbioanalyzerでの値を用いました。Bioanalyzerでも分光光度計の測定値がベースになっていますが、補正が入っています（下記参照）。 http://www.genome.duke.edu/cores/microarray/services/rna-qc/documents/Quantitation with agilent bioanalyzer ribogreen UV.pdf

(無題) 削除/引用 No.3694-10 - 2015/01/05 (月) 08:52:15 - RT 返信ありがとうございます． 回答が遅れてしまい申し訳ありません． >RIN様 ありがとうございます． qualityに関しては泳動のみ(うちではそれ以外の方法がないので）しかしていませんが，外注してチェックすることも考えてみます． ちなみにですが，そのような場合はデータとしてどう扱ったのでしょうか？やはり，ずれやqualityに問題があるということで，データにはしなかったのでしょうか？ 定量に関してはGE社のsimpli nanoを使って測定しているのですが，RNAの定量は分光光度計を使う方法以外に何かありますか？ リファレンス遺伝子についても，自分で他に検討してみます． >hana様 やはり，そうですよね．リファレンス遺伝子についても再検討してみます． >おお様 臓器は，腎・肝です．腎臓に関しては，皮質・間質・髄質を全て含んだ状態でRNA抽出を行っています． controlはb-Actinです．

(無題) 削除/引用 No.3694-9 - 2014/12/29 (月) 01:11:28 - RIN 普遍的かどうかは分かりませんが、マウスの小腸から抽出したRNAでqRT-PCRを行った経験上、個体間でCt値１程度のばらつきが見られる事は結構ありました（手技が悪かっただけかもしれませんが）。色々原因検討したのですが、RNAのqualityが結構ばらつく事が主な原因ではないかと結論しました。例えば、0から10のレンジでRNA qualityを定量化した場合、8から10程度のばらつきが見られ、結果に影響するようでした。このばらつきは見た目のrRNAプロファイルだけでははっきりしなかったので、RNAのquality controlをどこまでやるかが重要な気がします。ちなみに培養細胞から抽出したRNAを用いると、定量値で9.7から10の間でそろい、コントロールの発現もほぼ一定でした。 また、RNAの定量（qualityではなくquantity）でも、定量方法によって値が結構異なる（絶対値だけでなく、他のサンプルとの相対値でも）サンプルがあり、そのようなサンプルではRNA qualityが低い傾向があったように記憶しています。テンプレートの時点でのばらつきは、気をつけた方がいいかもしれません。 レファレンス遺伝子によっては、pseudogeneの関与を否定できない場合があり (http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0041659)、 各種レファレンス遺伝子（pseudogeneが問題にならない遺伝子を含め）について同じサンプルで調べてみましたが、ほとんどのレファレンスが同じ傾向を示しました（例えば、Gapdhが低めのサンプルでは、Hprtも低め）。よって、私のサンプルではpseudogeneはあまり問題ではないと結論しましたが、レファレンス遺伝子の選択は気をつけた方がいいかもしれません。 繰り返しになりますが、あくまで個人的な経験に基づくので、普遍的かどうかはコメントできない点、ご理解下さい。

(無題) 削除/引用 No.3694-8 - 2014/12/26 (金) 18:35:47 - hana 作り直しても改善されないようなのでしたら、発現が一定ではないか、RNAの質が均一ではないとかかなぁと。 コントロールを変えてみるのも手だとは思いますが。 私の場合は、RNA量以外の理由でコントロールが揃わないときは、違うものに変更しています。 というか、ばらつく前提でかけたことがありません。

(無題) 削除/引用 No.3694-7 - 2014/12/26 (金) 16:33:10 - おお 個人的にはあまりクリアーに答えられるほどデーターをみてませんけど、臓器は具体的にどの器官のどの部分か開示した方が答えがつきやすいかもです。できればinternal controlにおいている遺伝子名も。それをオープンにして支障があるなら仕方ありませんけど。

(無題) 削除/引用 No.3694-6 - 2014/12/26 (金) 15:46:49 - RT 返信ありがとうございます． 質問に関してなんですが，私の実験とは関係なしに，動物のサンプルを用いた場合，バラつきが出るということがどの程度普遍的なのかご存知の方がいらっしゃいましたら，その場合はどの程度ばらつくかも含めてご教授お願いいたします． >hanaさま > 作成からやり直したときは、ばらつきは改善されるのでしょうか？ > 多少は，といった感じでしょうか．傾向は変わらない様に思います． >おおさま > 実験群の間で差の開きが2倍あり、対照群の間で差の開きが2倍あったとき、どの程度精度で実験群と対照群に差がないといえるのかなと思った次第です。10例全部含めて平均でほぼ一緒ということですか? > > 平均すると，実験群と対照群ではほぼ差はないんですがね． > > なにか明らかな理由がない限りその処理は危険じゃないでしょうか。outlier testというのがありますが、それを使ってもあまりよくないという話もあります。最大値と最小値で2倍ならあるかもしれません。残りはどの様な分散をしていたのか気になります。 その時は，手技のせいだと安易に思ってしまったというのもあります．残りのものは，1.3倍前後程度に，おさまっている感じでした． > > internal controlでomitしたサンプルは実際に調べた遺伝子の動きはどうでしたか? それも同じように変動しているなら、データーとしてはそろっていると見てもいいでしょう。 なるほど． 同じような変動は示しているのですが，まだ，再現性はとっていないので（現在測定中)今の段階では何とも言えない感じですかね．

(無題) 削除/引用 No.3694-5 - 2014/12/26 (金) 12:24:04 - hana > (内在性コントロールがばらついたときは，cDNAの作製からやり直したりしています） 作成からやり直したときは、ばらつきは改善されるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3694-4 - 2014/12/26 (金) 09:13:48 - おお >[Re:3] RTさんは書きました : > おおさま > > 返信ありがとうございます． > > RNAの分解に関しては泳動のみですが，一応確認しており，問題ないと判断しています． 了解 > > 個体間でばらつくという話なんですが，PCR機器のメーカーの方が以前，動物の場合は多少ばらつくとおっしゃっており，その多少というのがどの程度のものなのかと思った次第でして． あまりこの辺は経験が豊富でないのでいろいろ意見をまちましょう。 > > 私の実験での2倍差はn=10の中での最小のものと最大のものの差が2倍といった感じでした． 実験群の間で差の開きが2倍あり、対照群の間で差の開きが2倍あったとき、どの程度精度で実験群と対照群に差がないといえるのかなと思った次第です。10例全部含めて平均でほぼ一緒ということですか? >その時は，その2個体は省いて解析を行いました． なにか明らかな理由がない限りその処理は危険じゃないでしょうか。outlier testというのがありますが、それを使ってもあまりよくないという話もあります。最大値と最小値で2倍ならあるかもしれません。残りはどの様な分散をしていたのか気になります。 internal controlでomitしたサンプルは実際に調べた遺伝子の動きはどうでしたか? それも同じように変動しているなら、データーとしてはそろっていると見てもいいでしょう。そういうばあいは精製度の微妙な違いでRTの効率が違ったりしたのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3694-3 - 2014/12/26 (金) 08:10:41 - RT おおさま 返信ありがとうございます． RNAの分解に関しては泳動のみですが，一応確認しており，問題ないと判断しています． 説明不足で申し訳ありません． 個体間でばらつくという話なんですが，PCR機器のメーカーの方が以前，動物の場合は多少ばらつくとおっしゃっており，その多少というのがどの程度のものなのかと思った次第でして． 私の実験での2倍差はn=10の中での最小のものと最大のものの差が2倍といった感じでした．その時は，その2個体は省いて解析を行いました．後は，実験群と対照群で一貫性のあるバラつきではなかったので，実験群と対照群の差が2倍になることはないかと判断しています．一応，文献でも内在性コントロールとして使われていることは確認しております．

(無題) 削除/引用 No.3694-2 - 2014/12/25 (木) 17:07:40 - おお そもそも個体間でそんなにばらつくもんでしょうか。 >対照群と実験群で内在性コントロールが動かないであろうことは確認しています． でも個体間で2倍違うことがあるんでしょう、、、なので対照群と実験群で2倍違うこともあるのが自然ではないですか? RNAの分解は疑う余地がないでしょうか?ほんとにそう言う差が出るならinternal controlとしてはあまり適切ではないとも思えますので、変えるという手もあるかもしれません。

リアルタイムPCR　内在性コントロール 削除/引用 No.3694-1 - 2014/12/25 (木) 17:00:14 - RT いつも勉強させていただいています． リアルタイムPCRについて質問させていただきたいことがありトピックを 立てさせていただきました． 動物の臓器を用いたPCR実験において内在性コントロールの個体間のバラつきはどの程度まで許容できますでしょうか？ 私が実験した時は，最大で2倍程度ばらついた時があります． (内在性コントロールがばらついたときは，cDNAの作製からやり直したりしています） duplicateで実験は行っており，duplicate間でのバラつきはありません． (あった場合は手技の問題としてやり直しております） 対照群と実験群で内在性コントロールが動かないであろうことは確認しています． 動物はラットを使っています． よろしくお願いいたします．

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