全14件 ( 1 〜 14 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.3720-14 - 2015/01/24 (土) 16:49:29 - spethan プライマーを変えて試したところうまくいきました。 プライマーを変えたらうまくいったと言う結果にはなりましたが、様々な条件検討の仕方を教えていただきありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.3720-13 - 2015/01/21 (水) 13:33:23 - おお nested ができるプライまーがあるならやってみてもいいかもよ。

(無題) 削除/引用 No.3720-12 - 2015/01/21 (水) 12:39:40 - ぴ とりあえず今の時代、2.2kbpの増幅なんて短いレベルです。 普段から6kbや長い時は10kb以上を増幅しますが、しっかり伸びます。 ポリメラーゼの影響はかなり大きいですね。ダメなものは全くダメです。 ポリメラーゼを変えてダメならプライマーを長くするなどですね。 NEBのQ5は全体的にうちではかなり好成績です。一度サンプルで試してみては？ むしろ500bp以下を増幅する事が最近全然ないなぁ。。。

(無題) 削除/引用 No.3720-11 - 2015/01/21 (水) 11:40:01 - ing 線虫株は冷凍保存で数カ月ごとに起こし直しますが、管理が不適切なラボでは標準株にすら変異が蓄積していて、、、なんて話は定期的に出てきますね。 過去に変異原処理やEXアレイのインテグレーションなんかをしているのにバッククロスが不十分な場合には、目的の配列がそもそも存在しない場合もあると思います。 PCRが改善しないようなら疑ってみてもいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3720-10 - 2015/01/20 (火) 06:33:38 - おお ところでC.elegansはSNPsやゲノム配列のバリエーションはどうなんでしょうかね。

(無題) 削除/引用 No.3720-9 - 2015/01/17 (土) 15:08:52 - いぬ プライマーの配列を再確認して酵素変えてフツウの条件でやる。 何も出ないなら再設計。 何度もPCRするよりお金と時間の節約になる。

(無題) 削除/引用 No.3720-8 - 2015/01/17 (土) 01:21:50 - おお もしどうしてもというならtemplateを濃縮するてはあります。そのはいれつで切れない制限酵素できって、その配列が含まれるDNAふらぐめんとのサイズを確認して、あがロースゲルでえいどうして、そのサイズのあたりを切り出して抽出したDNAをテンプレートとしてつかうとかかりやすくはなるとおもいます。 酵素はなるべくゲノムでよく使われる非常に切れやすい酵素で、完全に消化できるようにしてください。

(無題) 削除/引用 No.3720-7 - 2015/01/17 (土) 00:28:25 - おお どんなコンディション(温度とか)でどんな酵素をつかってどの様な溶液でやったんでしょうかね。。。 どなたかかかれてましたが私は温度条件でざっとふってだめなら酵素を変えます。とくにATリッチとかでどうこうということはいっさい考えません。Phusion (NEB)やprimestar (TAKARA) (なまえあってるかな)はよく増えます。そのたTAKARAのpyrobestとかも愛用してたことがあります。手元になかったらちょっと隣のラボとかいって1回分ぐらい分けてもらう手もあるかもしれません。それかサンプル(試供品)以来をするか。 あとプライまーの配列が間違えていたとか言うこともごくまれにあるので、再確認されてなかったら一度した方がいいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.3720-6 - 2015/01/16 (金) 22:09:49 - spethan ﾀｯﾁﾀﾞｳﾝPCR等を試してみましたが、うまくいきませんでした。 FwプライマーがATリッチなものを使っているのですがATリッチなプライマーを使うときはどの様な工夫をすればバンドが出やすくなりますか？

(無題) 削除/引用 No.3720-5 - 2015/01/11 (日) 10:22:35 - papa Gflexなど他のポリメラーゼを用いてみてはどうでしょう。 他のポリメラーゼで全然増幅しなかったものが，いともかんたんに増幅したことがあります。 PCRコンディション条件の設定で何週間も費やしたのに。

(無題) 削除/引用 No.3720-4 - 2015/01/10 (土) 12:18:15 - spethan 回答ありがとうございます。 プライマーはfwがtm値52度 rvが60度です ﾀｯﾁﾀﾞｳﾝPCRを試してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.3720-3 - 2015/01/10 (土) 01:23:59 - おお >アニーリング温度は25℃ 25℃は低すぎです。50度から68度で温度を振ってみて最適な条件を見つけてください。低い温度でまったくバンドが出なくっても、温度をあげるとバンドが出る場合もあります。あとDNAを入れすぎるとかえってかからなくなる場合があります10ngぐらいで十分です。 温度の条件を振るのがめんどうだとか、それでもノンすぺが出て都合が悪いならtouch downでPCRするてもあります。通常のPCRよりスペシフィックな増幅が可能になることがよくあります。 2.2kと少し長いので100や200bpぐらいのPCRよりは難しいとはおもいますが、不可能ではない長さではないと思います。念のためDMSOやベタインを入れとくといいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3720-2 - 2015/01/10 (土) 01:21:49 - どぴゅ アニーリング温度25℃・・・。 プライマーのTm値はいくらなんですか？ あくまでTmは目安です。下げることもありますし、上げることもあります。 タッチダウンPCRなどを試すこともありますね。 とりあえず25℃でPCRをかけた事はありません。 プライマーの情報をもっと出して下さい。なんとも言えません。

C.elegansのゲノムDNAを用いたPCRがかかりません 削除/引用 No.3720-1 - 2015/01/09 (金) 23:20:49 - spethan 今私はC.elegansから抽出したゲノムDNAを使ってPCRをしていますがまったくバンドが出ません。 自分が増幅したい領域以外を増幅させるプライマーではバンドが出たのでDNAには問題がないと思います。増幅したい領域は約2200ｂｐです。 アニーリング温度は25℃までさげてやってみました。アニーリング温度は低すぎるてもよくないのでしょうか？またTm値よりも逆に温度を上げた方がバンドがでるということもあるのでしょうか？ プライマーの再設計は最後の手段と考えているので、プライマーの再設計以外で何かアドバイスを頂けたらとおもいます。

全14件 ( 1 〜 14 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---