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(無題) 削除/引用 No.3723-14 - 2015/01/13 (火) 01:46:51 - おお >[Re:9] いぬさんは書きました : > 単純に他のNotサイトを見落としてて変なものを作ってる可能性とかは？ > > cutチェックするときにNot以外で3〜4cutするものを使ったほうが確実。 > 配列は解ってるんですよね？ これだとあとでNotIがつぶれていたっていう落ちが気になります。。。まあベクターが目的のものかどうかとか、方向決めたりもあるので、、、Not I以外できってめぼしいものにあたる方がいいでしょうけど。

(無題) 削除/引用 No.3723-13 - 2015/01/12 (月) 18:07:20 - seven 方向性も重要なライゲーションの場合ならPCRでinsertionチェックしたほうが結果的に速く終わるのではないでしょうか？ 載せ替え後のベクターに特異的な配列が切断部位の近辺にないと駄目ですが。 ベクターが一般的なものなら情報公開したほうが解決がはやくなるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3723-12 - 2015/01/12 (月) 12:54:48 - おお Ligase やAPなどが実際にきいているかなど確実に知ることが確かに必要ですね。

(無題) 削除/引用 No.3723-11 - 2015/01/12 (月) 12:41:10 - ~ 書かれている情報からは、トラブルが起きていることは分かりますが、 何が起きているかは分かりません。 ただ、元のベクター2種類の配列情報か、操作のいずれかに問題があると思います。 やれることとしては、下記のようなものがあります。 1各ベクターのマップと配列と電気泳動像(制限酵素処理ありなし)を見比べて、 配列情報が正しいか確認する。 2得られたコンストラクトを、インサートが入っていた側のベクターと 入れようとしていたベクターのそれぞれが切れてできたものと想定して、 適当な制限酵素で切ってどちらであるかと、何が起きているかを推測する。 3得られたコンストラクトを適当な制限酵素で切ってサブクローニングし、 配列を読んで何が起きているかを推測する。 4入れようとしていたベクターをAP処理せずにセルフライゲーションさせて、 1cutで6kbになるものが得られるかを確認する。 5別の制限酵素で目的が達成できないか考え、 並行してそのコンストラクトも作る。

(無題) 削除/引用 No.3723-10 - 2015/01/12 (月) 02:50:07 - おお insertもplasmidもNot I cutで作ってからligationしてますからね。。。

(無題) 削除/引用 No.3723-9 - 2015/01/11 (日) 19:58:40 - いぬ 単純に他のNotサイトを見落としてて変なものを作ってる可能性とかは？ cutチェックするときにNot以外で3〜4cutするものを使ったほうが確実。 配列は解ってるんですよね？

(無題) 削除/引用 No.3723-8 - 2015/01/10 (土) 16:38:47 - おお >[Re:6] KKさんは書きました : > 全てのご質問に答えておりませんでした。 > コンピの効率は、どのような指標があるのか承知しておりませんが、通常のベクターを増やす分には10ulで十分な程度の効率です。 10ulじゃあDNAがどれだけあるのかわかりませんが、まあ濃度は0.1-1ug/ulといったところでしょうから、そんなに使ったらコロニーが拾えなくなるほどいっぱい生えてきそうです。そう考えるとplasmid constructionに使えるほどの効率をもったコンピテントか疑わしいと思いますが、もっと具体的な数字が欲しいところです。 指標については1ugDNAを入れたときに何個コロニーができるかとい指標があります。ただし本当に1ug入れてしまうといろいろな意味で正確に図れないので10ngぐらいでチェックすることがたいていだとおもいます。

(無題) 削除/引用 No.3723-7 - 2015/01/10 (土) 16:12:20 - AP >uncutのベクターではおよそ4kになることを確認しており、 それは移し替え先のベクター標品ということですね？ 精製したプラスミドがちゃんと切れているのかどうかははっきりしていますか？やはり制限酵素処理なしの対照は置いたほうがいいと思います。意外とインフォーマティブです。入れ替えようとしたベクターそのものではないにしても、たしかにリニアなのか、cccなのかははっきりさせておきたい。 もしリニアが確実なら、たんに無関係のプラスミドのコンタミですよ。3 kb付近のプラスミドベクターはありふれていますしね。

(無題) 削除/引用 No.3723-6 - 2015/01/10 (土) 16:06:02 - KK 全てのご質問に答えておりませんでした。 コロニーは、水　〜10　インサート入りが100〜　という差が出ております。 コンピの効率は、どのような指標があるのか承知しておりませんが、通常のベクターを増やす分には10ulで十分な程度の効率です。

(無題) 削除/引用 No.3723-5 - 2015/01/10 (土) 15:58:34 - KK 皆様、ご回答ありがとうございます。 >>AP すみません、書き方が間違っておりました、ベクター側のみ行っています。 >>インサートのプラスミド インサートも6kのベクターに、今回別のベクターに移したいインサート2k　の合計8kのプラスミドです。 なので、こちらのベクターがコンタミしたとしても3kにはならないと考えています。 >>ベクター 1.5ugをカットし、ゲルからカラムを使って精製し、最後に20ulでEludeさせています。ここから、0.5ulをライゲーションに用いています。 精製後のプラスミドがおよそ25ng/ul程度なので、およそ12ngをライゲーションしております。 >>CCCについて uncutのベクターではおよそ4kになることを確認しており、今回カットチェックで見えているバンドは3kよりもやや下に出てきているので、uncutが見えているわけではないと考えております。 引き続き宜しくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.3723-4 - 2015/01/10 (土) 15:40:31 - おお お書きになった文章を読む限りはインサートもAP処理しているように思えるのですが、、、 ちなみにインサートだけのligationでコロニーができますか。インサートを切り出した方のベクターのサイズはどれくらいでしょうか。インサートがわにきったプラスミドが混じっている可能性がないでしょうか。微量でも入っているとそっちがドミナントになる可能性があります。 ベクターはどれぐらいの量をligationして、何個コロニーが得られましたか?コンピの効率はどの程度のものをお使いでしょうか?

(無題) 削除/引用 No.3723-3 - 2015/01/10 (土) 15:38:24 - ~ >インサート、ベクターはそれぞれ両側NotIで切断+AP処理をし この書き方だと、インサートもAP処理したことになりますが… もともとインサートが入っていたNotIで1cutされるベクターが3kbで、 それがセルフライゲーションしたものを拾って いる、 ということはありませんか？ インサートのみでライゲーションしてみるか、 すでに抽出済みのコンストラクトを元のベクターが2cutされるような条件で 切ってバンドパターンをみてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3723-2 - 2015/01/10 (土) 15:05:30 - AP 精製したプラスミドを制限酵素処理なしで泳動したものと比較はしていますか？ 可能性としては、制限酵素処理前と処理後で変化なし、つまり切断されていないため、3 kb付近のバンド一本のみが見えているということもあります（もしそうであれば、ベクター 6 kbのcccフォームならそれに相当するはずです）。

プラスミド作成　カットチェック 削除/引用 No.3723-1 - 2015/01/10 (土) 14:39:45 - KK 初歩的な話題で申し訳ありませんが、非常に困ってしまっているので質問させて下さい。 プラスミドに存在するインサートを別のベクターへ、制限酵素・ライゲーションにて移し替えるという基本的な操作をしています。 インサート、ベクターはそれぞれ両側NotIで切断+AP処理をし、ゲル泳動、切り出し、カラムを使用してゲルから断片を抽出、Nippon geneのligation mixにて16度30分でライゲーション、トランスフォーメーション、Ampプレートへプレーティング　 翌日　コロニーピックし、更に翌日、Miniprepをし、まずはじめにNotIにてカットチェックをしています(インサートの向きはその後に調べる予定です)。 ベクターは6k、インサートは2kであり、カットチェックでも6k、2kのバンドが出れば当たり、6kだけならハズレであると予測されますが、何故かチェックしたバンドがすべて3k付近に出てきます。 切り出しの際及びゲル抽出の後に、インサート、ベクターがそれぞれ目的サイズに存在していること ライゲーションの際、インサート+ベクター、水+ベクターというコントロールを置き、水コントロールに比べてコロニーピックの際に10倍以上の差があること は確認しています。なぜこのような説明の付かないバンドが出てきてしまうのか理由が全く分かりません。 このような場合に、どのような対処法があるのかご教授頂ければ、大変ありがたいです。 宜しくお願い致します。

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