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(無題) 削除/引用 No.3751-17 - 2015/01/22 (木) 06:44:29 - F みなさま、大変詳しい各種コメント、誠にありがとうございました。 とっても参考になりました。 > この分野は私は全くの素人ですが、素人なりに考えるに、もしアロステリック制御を念頭において結晶構造解析するならば、当該蛋白質が他の低分子化合物（薬剤を含む）あるいは他の蛋白質と（非共有結合的に）結合した状態と、しないときの状態の高次構造を捉えて比較することに関心をもつのですがどうでしょうか。 おっしゃるとおりです。非常に似た構造にも関わらず、活性があるものとないものがありまして、 その違いについて結晶構造解析するのが目的です。さすが、鋭い視点です。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3751-16 - 2015/01/19 (月) 10:57:26 - ~ おお さんが引用されたのと同じ量で結晶化条件の探索を受けてくれる日本の会社があるようですね。 ttp://www.so-sho.jp/techinfo/faq2.php >つまり、100条件のスクリーニングをする場合、最低50ulの溶液 >（タンパク量：0.25〜0.5mg）をご用意ください。 価格も22万円くらいなので、それほど高くはないかと。 ttps://www.lifetechnologies.com/jp/ja/home/life-science/protein-expression-and-analysis/transfection-selection/freestyle--max-system.html のような市販品で、動物細胞でmgオーダーのたんぱく質生産を期待できますので、 L単位での培養ができるようなフラスコやスピナーを用意できれば、 力技で何とかなるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3751-15 - 2015/01/19 (月) 10:01:55 - ~ >[Re:9] Fさんは書きました : > ウェスタンのバンドがシフトするほどの違いとして認められなければ > 修飾パターンはほぼ同じと考えるものなのでしょうか？ SDS-PAGEの移動度が変わることは、何かタンパク質に変化が生じていることを裏付けるデータになりますが、 移動度が変わらないことは、タンパク質に変化が生じていないことを示しません。 結晶化において、その変化の影響がどの位なのかはさっぱり分かりませんが。 既に想定されている「先方」がいるのですよね。 その「先方」の出した論文には、結晶化したタンパク質の由来が書かれているのではないでしょうか？ 複数の由来のタンパク質を結晶化しているラボであれば、どれがいいかという話ができるでしょうし、1種類の系でしかたんぱく質を作っていないラボであれば、その系以外の方法は頼みにくいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3751-14 - 2015/01/19 (月) 02:47:19 - おお ちなみにS/TをEやDに変えたからといって絶対にうまくいくとはかぎりません。-電荷の数が違いますし。

(無題) 削除/引用 No.3751-13 - 2015/01/19 (月) 02:03:58 - おお >・大腸菌で発現させたリコンビナントもオプションのひとつとして考えたいのですが、 >翻訳後修飾がない点などは、どのように考えて解析、interpretすべきでしょうか？ 大腸菌を使って提案できる一つのモデルということでいいんじゃないですか。具体的にどのアミノ酸で、解析されたどこに位置するかがわかるなら、得られた結果をもとにそこに修飾が入ればどうなるか考察すればいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3751-12 - 2015/01/19 (月) 01:58:51 - おお >[Re:9] Fさんは書きました : > > 遺伝子組換え細胞にたんぱく質を作らせる場合、 > > タンパク質の発現量が多くなると修飾のパターンが変わる > > （修飾されていないタンパク質が増える等）ことがあります。 > > ウェスタンのバンドがシフトするほどの違いとして認められなければ > 修飾パターンはほぼ同じと考えるものなのでしょうか？ > 例えばリン酸かしてもSDSPAGEで分離されないものもあります。 リン酸かによる変化を見たいのであれば大腸菌をもちいたばあい、修飾されるS/TをEやDに代えるということはよくやられていると思います。 そのたメチル化、アセチル化も電荷が変わりますので同じような方法論が使えるかもしれませんが、詳しくはわかりません。ご自身で調べてみてはどうでしょうか。 糖修飾は、、、酵母使うかなぁ。。。 また、大腸菌にない修飾を、大腸菌にその修飾酵素を発現させたうえで、目的の蛋白を発現させるという試みも見かけます。この場合も過剰発現のばあいの修飾される割合は気になりますけど。

(無題) 削除/引用 No.3751-11 - 2015/01/18 (日) 13:54:25 - 名無し 既に十分知っているとはおもいますが、翻訳後修飾には現在分かっているものだけでも極めて多種多様なものがあり、当然、反応様式などもまた多様ですので、分子量（大きな糖鎖の付加やユビキチンやUBLs化あるいは等電点のシフト（リン酸化など）するものもあるし、またそうした変化を示さないものもまたあります。あと翻訳後修飾はとくに真核生物に限定されたものでなく原核生物でも普通にあります。もちろん、中には真核生物にしかみられないものもあるし、同じような修飾でも修飾部位がちがうものもあるとはおもいますが。 アロステリック制御で翻訳後修飾が特に重要と考えたのはなにか具体的な根拠があるのでしょうか。もしあれば具体的にどのような修飾を想定しているのでしょうか。あくまで教科書的な一般的な理解では両者がちょっとすぐにつながらないので。 この分野は私は全くの素人ですが、素人なりに考えるに、もしアロステリック制御を念頭において結晶構造解析するならば、当該蛋白質が他の低分子化合物（薬剤を含む）あるいは他の蛋白質と（非共有結合的に）結合した状態と、しないときの状態の高次構造を捉えて比較することに関心をもつのですがどうでしょうか。 動物細胞では蛋白質の量的質的管理機構が非常に発達しているので、大腸菌のように外来蛋白質を大量に発現させる事は通常、困難です。高度に精製するのもまた大腸菌の時のように容易ではありません。なので精製目的の宿主としてはけっして適切ではありません。酵母とかならまだなんとかなるかもしれませんが。

(無題) 削除/引用 No.3751-10 - 2015/01/18 (日) 10:07:30 - F >[Re:6] 名無しさんは書きました : > 10年くらい前の話ですが、蛋白質の結晶化に取り組んでいる人が周りに何人かいました。こうすればうまくいくとか、そういったものが少ないこともあり、至適条件の設定等、見ていて気の毒なくらいでした。成功するかどうか見通しのたちにくく、地味でかつ根気のいる実験の繰り返しにときに数年の時間を投入することにもなるわけで、少なくとも私の知りうる限り最も大変な研究課題だとおもいました。コラボで他者にやってもらうことを想定されているならば、その辺の事情を理解した上で、ほんとうに結晶構造解析データが必要な情報なのかどうか、十分に考えた上で、それでどうしてもというならば、相手の事情や意向を十分に尊重してお願いした方がよいようにおもいます。 はい、おっしゃる通りだと思います。 先方に失礼にならないようにこの点に配慮したいがために、先方にお伺いする前に できるだけ実験の妥当性を自分で理解、咀嚼しておきたかったので、こちらで 質問させてもらいました。 私の周りにもx-ray crystallographyやられてるラボがいくつかありました。 おっしゃるように大変地道な泥臭い作業をやられていました。 とても大変だと思います。

(無題) 削除/引用 No.3751-9 - 2015/01/18 (日) 10:02:58 - F コメントありがとうございます。 > 遺伝子組換え細胞にたんぱく質を作らせる場合、 > タンパク質の発現量が多くなると修飾のパターンが変わる > （修飾されていないタンパク質が増える等）ことがあります。 この点について、常日頃から疑問に思っていることがあります。 overexpressさせたタンパクの修飾パターンの変化についてですが、 ウェスタンのバンドがシフトするほどの違いとして認められなければ 修飾パターンはほぼ同じと考えるものなのでしょうか？ ケースバイケース、としか言いようがないと思いますが、 他の簡便な調べ方などあまり知らない、手慣れていない、ということもあり、 自分でそれ以上調べようとしたことはあまりないのですが、 ご意見などいただけると幸甚です。

(無題) 削除/引用 No.3751-8 - 2015/01/18 (日) 09:56:24 - F おおさん >[Re:4] おおさんは書きました : > ものによっては牛や豚などのよく発現している臓器を集めた方がいいかも知れん。。。 >[Re:3] おおさんは書きました : > An Initial screen of 96 conditions within one temperature setting and one protein concentration can require a minimum of 50 microlitters of five milligrams per ml of your protein (i.e. 250 microgram in total). And this is the flat minimum! > 途方もない数字ですね。。。 具体的な数字を挙げてくださり、ありがとうございます。 こう考えると、やっぱり大腸菌使うほうが賢明かなと感じます。 使いたいタンパクが高発現している臓器というのもよく知られているので、 動物の臓器を使うというアイデアも検討してみます。 私はタンパク精製をまぁまぁやってましたが、だいたいタグ付いてるものの affinity purificationばかりだったので、nativeなものの精製となると ちょっと敷居が高いですかね。。精神的にも。 まずは参考文献を探します。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3751-7 - 2015/01/18 (日) 09:40:32 - F WInter8さん 詳しいコメント、ありがとうございます。 >[Re:2] WInter8さんは書きました : > それと、mammalianの系だと翻訳後修飾にばらつきがでるという話を聞いたことがあります。 > そのようなバラツキは結晶化の妨げになるので、サンプルの均一性を保てる発現系が必要です。 このポイントはoverexpressしたタンパクについてはよく言われることだと思いますが、 とても気にしているところです。翻訳後修飾を気にして、労力の多い発現系を選択したにも 関わらず、それが逆に問題となる、というのでは本末転倒もよいところですよね。 実際、mammalianの細胞にターゲットタンパクをtransientにoverexpressしても 化合物の感受性に変化なかったんですよね。いま、ここで悩んでるとこです。 ターゲットと思っていたものがそもそも違うのか、overexpressでのこの系が 翻訳後修飾や発現量の問題で細胞にとって適切でないのか。 実際、発現量はbase levelと比較して、ウェスタンのdensitometryでみたとき 50倍以上です。 > まずは大腸菌発現系でターゲットのタンパク質がとれるかどうかです。 > 活性のあるサンプルが調製できたなら、結晶化を試してみても良いかもしれません。 > まずは結晶構造解析以外の実験で妥当なサンプルかどうかをご自身で判断されてみては？ なるほど。そのタンパクの酵素活性を指標にfunctionalかどうか、判断して 結晶化に用いる、ということですね。適切なアドバイスをありがとうございます。 > よく指摘されることですが、少なくともエネルギー的に安定な一状態を見ていることは確かです。 > ネガティブな言い方をすると、結晶構造解析よりも高分解能でより正確な立体構造を決める方法が今のところ無いので、仕方のないことだという見方もできます。 > データ解釈の留意点はいろいろあります。分解能＝データの質ではない...など。 > おっしゃるように、ほかにあれだけパワフルな解像度で立体構造みる手法は ないですものね。私もそう思います。 貴重なご助言ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3751-6 - 2015/01/17 (土) 00:09:36 - 名無し 10年くらい前の話ですが、蛋白質の結晶化に取り組んでいる人が周りに何人かいました。こうすればうまくいくとか、そういったものが少ないこともあり、至適条件の設定等、見ていて気の毒なくらいでした。成功するかどうか見通しのたちにくく、地味でかつ根気のいる実験の繰り返しにときに数年の時間を投入することにもなるわけで、少なくとも私の知りうる限り最も大変な研究課題だとおもいました。コラボで他者にやってもらうことを想定されているならば、その辺の事情を理解した上で、ほんとうに結晶構造解析データが必要な情報なのかどうか、十分に考えた上で、それでどうしてもというならば、相手の事情や意向を十分に尊重してお願いした方がよいようにおもいます。

(無題) 削除/引用 No.3751-5 - 2015/01/16 (金) 17:09:20 - ~ 修飾たんぱく質の分離は覗いたことがありますが、結晶化は全くの素人です。 遺伝子組換え細胞にたんぱく質を作らせる場合、 タンパク質の発現量が多くなると修飾のパターンが変わる （修飾されていないタンパク質が増える等）ことがあります。 そのため、遺伝子組換え細胞に作らせるのであれば、 小スケールの予備検討と、条件検討を行って発現量を増やした後では、 違う修飾パターンになっているかもしれません。 また、イオン交換カラムなどで修飾の異なるたんぱく質を分けて結晶化すると、 修飾による構造変化の解析ができるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3751-4 - 2015/01/16 (金) 14:47:02 - おお >mammalianの細胞で発現 ものによっては牛や豚などのよく発現している臓器を集めた方がいいかも知れん。。。

(無題) 削除/引用 No.3751-3 - 2015/01/16 (金) 14:35:32 - おお ttps://benchwise.wordpress.com/2012/06/01/crystallography-for-beginners-making-the-move-into-protein-crystallography-part-1/ An Initial screen of 96 conditions within one temperature setting and one protein concentration can require a minimum of 50 microlitters of five milligrams per ml of your protein (i.e. 250 microgram in total). And this is the flat minimum! 途方もない数字ですね。。。

結晶屋としての意見 削除/引用 No.3751-2 - 2015/01/16 (金) 13:18:21 - WInter8 > ・アロステリックな構造変化も捉えたいので、翻訳後修飾が重要であろうとの推察から、 > mammalianの細胞で発現させたいのですがcrystallographyに必要なタンパク量を > 取るのは非現実的か？レギュレーションのためできるだけウィルスは用いたくないので、 > CMVプロモータなどのexpression vectorを使う予定です。細胞質に局在するタンパクなので、 > 分泌させるのではなく、細胞内で発現させたものを取ってきたいと考えています。 私は経験が無いのですが、mammalianの系で調製しているグループもいます。 ただ、お金がかかるので、昆虫細胞で試す場合が多いかと。 近縁タンパク質の構造解析の論文を探してみて、その方法に倣うのがよいかと思います。 それと、mammalianの系だと翻訳後修飾にばらつきがでるという話を聞いたことがあります。 そのようなバラツキは結晶化の妨げになるので、サンプルの均一性を保てる発現系が必要です。 > ・大腸菌で発現させたリコンビナントもオプションのひとつとして考えたいのですが、 > 翻訳後修飾がない点などは、どのように考えて解析、interpretすべきでしょうか？ > 私は、結晶構造解析できるだけ、すごいことだとは思うのですが、結構違うのではないかと > 考えてしまいます。 まずは大腸菌発現系でターゲットのタンパク質がとれるかどうかです。 活性のあるサンプルが調製できたなら、結晶化を試してみても良いかもしれません。 まずは結晶構造解析以外の実験で妥当なサンプルかどうかをご自身で判断されてみては？ > ・また、crystallographyの像はあくまでスナップショットですが、 > そのへんの考え方について、静的に得られた像が動的な状態の中にあっても、 > よく取る構造であることをどう担保されるのか、データの解釈時の留意点など > ご意見いただければ大変ありがたいです。\ > （私がよくやってるウェスタンでのシグナル解析などもスナップショットですが。。） よく指摘されることですが、少なくともエネルギー的に安定な一状態を見ていることは確かです。 ネガティブな言い方をすると、結晶構造解析よりも高分解能でより正確な立体構造を決める方法が今のところ無いので、仕方のないことだという見方もできます。 データ解釈の留意点はいろいろあります。分解能＝データの質ではない...など。

Crystallographyに用いるタンパク質の準備 削除/引用 No.3751-1 - 2015/01/16 (金) 07:41:29 - F とある薬剤とターゲット・タンパクとのinteractionの様式を crystallographyで解析してみたいと考えています。 自分ではできないので、コラボでお願いしようかな、と思っているのですが その前に最低限把握しておきたいことがありまして、ご経験のある方のご意見を いただければと思いました。 ・アロステリックな構造変化も捉えたいので、翻訳後修飾が重要であろうとの推察から、 mammalianの細胞で発現させたいのですがcrystallographyに必要なタンパク量を 取るのは非現実的か？レギュレーションのためできるだけウィルスは用いたくないので、 CMVプロモータなどのexpression vectorを使う予定です。細胞質に局在するタンパクなので、 分泌させるのではなく、細胞内で発現させたものを取ってきたいと考えています。 ・大腸菌で発現させたリコンビナントもオプションのひとつとして考えたいのですが、 翻訳後修飾がない点などは、どのように考えて解析、interpretすべきでしょうか？ 私は、結晶構造解析できるだけ、すごいことだとは思うのですが、結構違うのではないかと 考えてしまいます。 ・また、crystallographyの像はあくまでスナップショットですが、 そのへんの考え方について、静的に得られた像が動的な状態の中にあっても、 よく取る構造であることをどう担保されるのか、データの解釈時の留意点など ご意見いただければ大変ありがたいです。\ （私がよくやってるウェスタンでのシグナル解析などもスナップショットですが。。） 長いですが、よろしくお願いします。

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