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(無題) 削除/引用 No.3759-15 - 2015/01/21 (水) 16:10:57 - atomic おお様 ありがとうございます。 その方法でやる方がよりしやすそうですね。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.3759-14 - 2015/01/21 (水) 16:09:39 - atomic たくさんの回答をありがとうございます。 qw様 1,25万G遠心後の上清は液量変わらず1,5mlほど、その後超遠心をしても 大した沈殿はありませんでした(下がほんのちょっと白くなった程度) 超遠心後のタンパク量は10mg/mlぐらいです。 白い沈殿は(バッファーで洗浄し)懸濁させていますが、1ml/mlぐらいです。 単純に薄くなっただけに思います。　これを更にバッファーに溶かし、遠心ということでしょうか。 仰るとおりです。泳動は3つとも大きな変化はありません。 PIPESは微小管を好むとの意見を教授から頂きPIPESを使用しています。 また、論文でもPME、MESなどを使用しています。 ATB様 仰るとおりです。半透明ではなく白い不透明な白さです。 恐らくそのような気がします。 37℃でも他のたんぱくが変性し、一緒に落ちているのではないかと。 心臓はとってすぐにバッファーに入れ、血を抜いてから、 液体窒素で凍らせているのですがこの作業が余分だったのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3759-13 - 2015/01/21 (水) 06:23:28 - おお cushionとまじるのが問題であれば、先にサンプルをいれて、cushionをピペットですって、ピペット先端をサンプルの入ったチューブのそこまで持っていって、ゆっくりとcushionを底に流し込むというのも他の実験ではやることがあります。

(無題) 削除/引用 No.3759-12 - 2015/01/20 (火) 21:34:23 - ATB 超遠心後のペレットが白いというのは、半透明で白っぽいのではなく、不透明な白さなのでしょうか。 それだと、変性したタンパクが（少しの微小管と）一緒くたになってしまっているのでは。 それと、白い沈殿を泳動しても遠心前と同じ、ということは、チューブリンが重合していないのでは？ 重合能を保持したチューブリンを得るなら、フレッシュな臓器を使用するべきだと思います。 ラットの心臓がいくつ必要なのかわかりませんが、心臓だけを10-20個位なら数時間で得られるのでは？ 心臓を採取したらすぐに氷に浸けて冷やすのではダメなのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3759-11 - 2015/01/20 (火) 21:33:51 - qw ＞の二種類で試し　心筋一個(1g)に対し1.5mlに溶かしました。 ＞1,25万Gで遠心した後、上清を更に24万Gで遠心 その上清の液量は幾らなのですか？ 24万G上清にどの程度タンパク質が回収されているのでしょうか？ 濃くしたい余りに、抽出効率を激減させてている可能性はないでしょうか？沈殿をもう一度抽出bufferで再抽出してみて、それも重合させてみてはいかがでしょう？ ＞上清にTaxol GTPを20μM,1mM入れ、37℃で15分インキュベート ＞その後、5％のスクロース溶液100μlに重層　37℃で8万Gで遠心 ＞その後、上清を除き沈殿をバッファーに再懸濁させました。 SDS-PAGEで差がなかったのは、24万G上清、8万G上清、8万G沈殿三者に差がなかったのですか？そうであれば、有効に重合していないのでしょうね。 私は脳のMTしか取ったこがないので、心筋でどうなのかということに関して想像以上のことは判りません。 条件的に心筋のアクチンを選択的に除去できるような抽出になっていたりするのでしょうか？ PMEだとアクチンが沈殿してチュブリンが抽出されそうですし、LSEだとアクチンもチュブリンも抽出されるのかな？と思ったりするのですが、判りません。

(無題) 削除/引用 No.3759-10 - 2015/01/20 (火) 19:56:17 - atomic 遅くなりました。 こんなにもいろいろな方にアドバイスいただけると思っていませんでした。 本当にありがとうございます。 ＞qw様 とった心筋は液体窒素で瞬間凍結しています。 やはり、常温の時間が長いとチューブリンなどの収率は悪くなるのでしょうか。 クライオプレスは細かく粉砕され抽出効率は良いと聞いたのですが、 本当のところはどうなのかはわかりません。 仰るとおりMg、GTPは重合に必要だと聞きました。 勉強不足でMg−GTPというのがどういう状態かわかりかねますが タキソールを使うにしても必要なのではないかと存じます。 ＞おお様 なるほどクッションの容量を大きくすればいいのですね。 スクロースの濃度を濃くすることは論文にも書いてありました。 少し濃い濃度でしてみたいと思います。 心筋でしている論文は見つけていないのですが、各筋肉のチューブリン含有量のデータは ございました。そのデータを見る限りでは心筋が一番多いように思いました。 今も泳動いたしましたが、結果変わらず 一体どの工程がダメなのか一向に見当がつきません。

(無題) 削除/引用 No.3759-9 - 2015/01/20 (火) 14:52:55 - おお あと、心筋でやっている文献がないかさがしましたか?

(無題) 削除/引用 No.3759-8 - 2015/01/20 (火) 14:50:48 - おお あと脳とかでやった方がいいというのは、うまくいったときの感覚などつけるのにある意味必要かなと思うわけです。

(無題) 削除/引用 No.3759-7 - 2015/01/20 (火) 14:48:13 - おお http://journals.plos.org/plosbiology/article?id=10.1371/journal.pbio.0060098 こちらではsucrose 40%のcushionをつかってますね(ハエでやってますけど)。えんしんしてもきれいにならないということは、他のフィラメントや巨大な構造をとった蛋白、もしかしたら細胞膜などがのぞけてないかもしれませんね。cushionをもう少し濃くするといいのかもしれません。あとcushionに乗せるときにまざるのが原因と思えるなら、cushionのvolumeを増やすとやりやすいかもしれません。 としろうとながらにおもいました。

(無題) 削除/引用 No.3759-6 - 2015/01/20 (火) 14:31:10 - qw チュブリンを脳から精製するときは、フレッシュな脳を使うようになっていたと思います。「クライオプレスで粉砕」した組織からチュブリンを効率よく重合できるのでしょうか？ Mg濃度も重合にcriticalだけど、GTPはMg-GTPということですか？それとも、タキソールのときは必要ないのかな？？

アクチンについて 削除/引用 No.3759-5 - 2015/01/20 (火) 13:52:18 - atomic 具体的な論文を上げていいのか迷ったのですが、Methods in tubulin proteomicsという論文と この研究室のはるか昔の博士論文を参考にしています。 一応論文には脳以外の組織からも抽出できると書いてあります。 仰るとおりで、アクチンミオシンが多く溶け出してしまっています。 ミオシンがLSBに溶けないようなので、LSBを使って精製をしたりと試してみました。 ミオシンは除けましたが、アクチンは残ったままになりました。

返答ありがとうございます。 削除/引用 No.3759-4 - 2015/01/20 (火) 13:45:55 - atomic ありがとうございます。失礼しました。 操作としては、バッファーを変えて何回か試しています。 ラットの心臓をクライオプレスで粉砕 PMEバッファー(PIPES 100mM MgCl2 1mM EGTA 2mM pH6.8) LSBバッファー(リン酸緩衝液 2mM EGTA 2mM KCl 20mM pH6.8) の二種類で試し　心筋一個(1g)に対し1.5mlに溶かしました。 1,25万Gで遠心した後、上清を更に24万Gで遠心 上清にTaxol GTPを20μM,1mM入れ、37℃で15分インキュベート その後、5％のスクロース溶液100μlに重層　37℃で8万Gで遠心 その後、上清を除き沈殿をバッファーに再懸濁させました。 脳からの精製はしておりませんが、ひと通りの作業は読みました。 またいくつも質問して申し訳ないのですが 重層する際に静かに溶液を注いでも溶液が混ざってしまうように思います。 スクロース溶液で多少の勾配を作っているのに意味があるのかどうかも気になりました。

(無題) 削除/引用 No.3759-3 - 2015/01/20 (火) 13:29:52 - おお わたしも、いままでチューブりんを精製したことがないなら、よくエスタブリッシュされてた系で精製できるか確認するべきだと思います。 どんな論文のプロとコールを見てやっているのでしょうか?しんきんだと、アクチンが多すぎてじゃまなのかなぁという気がしないでもないですね。。。そうするとまずアクチンなどのぞいてからというのがいいのかもしれませんが。

(無題) 削除/引用 No.3759-2 - 2015/01/20 (火) 12:02:48 - qw あなたの操作方法が殆ど判りません。失礼ですが、説明しなおすほうが良いだろうと思います。 タキソールで安定化した微小管は、低温に晒しても溶けないだろうと思います。 脳からチュブリンを精製したことはあるのでしょうか？ ポジコンとして簡単なところから始めるほうが、状況を把握しやすいと思います。

脳以外の組織からのTubulin の精製について 削除/引用 No.3759-1 - 2015/01/20 (火) 11:38:58 - atomic 研究室で脳以外からの組織からチューブリンを精製することを行っています。 去年に出ていた論文のチューブリンのプロテオミクスなどを参考にしているのですが うまくいきません。何かコツが有るのでしょうか。 ラットの心筋1g程度を使用しています。粉砕して1,5倍のバッファーに溶かしました。 まず 超遠心をする意味はあるのか。(さらにうちの教授は論文にない超遠心前に一度弱いGで遠心しろというのですが…) GTPとタキソールを加えて、37℃に温めてからもう一度遠心をすると 白い沈殿ができるのですが、それが恐らくチューブリンかと思い泳動してみても 遠心前と全く同じです。 そもそも何回懸濁してもこの沈殿溶けないのですが、このようにして得た沈殿はもう溶けないのでしょうか。 使うバッファーはPIPESや、リン酸バッファーを使っているのですが問題があるのでしょうか。 どれでもいいのでお応えいただくと恐縮です。

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