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(無題) 削除/引用 No.3760-10 - 2015/03/05 (木) 16:22:47 - mon サンショウウオさんも指摘していますが、培地由来のCa・Naとトリプシン（及びその溶液由来のEDTA)を完全に除くためにトリプシン処理後、目的の懸濁液で２~3回洗う方が良いと思います。

ありがとうございました 削除/引用 No.3760-9 - 2015/03/05 (木) 12:22:36 - のす お久しぶりです。今回の件について事後報告です。 「digitoninが効いていない」or「効きすぎて細胞が死んでいる」ことを考え、それを確認する実験を行いました。 具体的には、digitonin添加前後に細胞のトリパンブルーによる染色を確認します。 本来トリパンブルーは膜透過性の上がった死細胞を染色する目的で使用しますが、同様にdigitoninによりセミインタクトとなった細胞に関しても染色されると考えてのことです。 結果、論文中でのdigitonin濃度においてほぼ全ての細胞に関し染色が見られ、digitoninは効いていることが確認できました。つまりカルシウムの取り込みが見られないのはdigitoninの効きすぎによる細胞死が考えられます。 現在、digitoninの濃度を振って適切な濃度を検討中です。 論文中の濃度でダメだったのは理由が不明ですが、皆さんのご指摘のように細胞、試薬の違いによるものなのかもしれません。 なんにせよ実験が前に進むことができました。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3760-8 - 2015/01/21 (水) 20:56:38 - のす おおさん 確かにdigitoninが効いてないとすれば結果に納得がいきます。 現在使っているのはblue-native pageに用いるための5%digitoninを使っていますが、やはり用途が違うので純度等に問題があるんですかね。 サンショウウオさん 書き方が悪かったのですが、PBS(-)で懸濁、遠心後はDMEMではなく測定に用いるためのmedium（pH7.4）を使用しています。 KCl：125mM、K2HPO4：2mM、MgCl2：1mM、HEPES：20mM、glutamate、malate、succinate：それぞれ5mMという組成となっています。 これは参考にした論文に記述されている組成でそのまま作って使用しました。 皆さん色々な意見ありがとうございます。 とりあえずプロトコル等について調べて再検討する方向になりました。

(無題) 削除/引用 No.3760-7 - 2015/01/21 (水) 14:57:29 - サンショウウオ 　培地中のカルシウム濃度は、DMEMの場合たしか1.8mMぐらいだったと思う。細胞室は100nM程度とかなり小さいです。 　 　おおさんも書かれていたけど、 　カルシウムイオン濃度が1mM以上と高い培地中にカルシウム指示薬入れるのは余りおすすめしない。試薬そのものがカルシウムバッファーみたいな働きするので。 　カルシウム指示薬を細胞内に導入するなら、カルシウムイオンを含まないPBSにCalcium Green-5Nを含ませて、その溶液でインキュベートして細胞内にCalcium Green-5Nを取り込ませたほうがいいと思う。

(無題) 削除/引用 No.3760-6 - 2015/01/21 (水) 14:21:34 - おお カルシウムによる蛍光がみれないので、ミトコンドリアへの取り込みによるcytosolのカルシウム減少が見れないということでしょうか。digitoninは確かに曲者なので、細胞膜の透過がうまくいってないのかもしれません。予備実験としてなにか透過性みれる蛍光試薬などで、digitoninの最適な条件を見つけるといいかもしれません。 digitoninも可溶成分を再精製したものなどおなじdigitoninでも同じとはいえないものが何種類か出回ってるようですから。

(無題) 削除/引用 No.3760-5 - 2015/01/21 (水) 13:52:45 - のす おおさん カルシウムはdigitonin処理後加えています。 指示薬に反応後（蛍光強度上昇）、細胞内のミトコンドリアに取り込まれる（蛍光強度減少）という反応を見るので一度反応はさせないといけないと思います。 イオノフォアでのポジコンはとっておりません。 細胞無しでのネガコン（バックグラウンド）は上の方の勧めで一度とりました。 ~さん Calcium Green-5Nの2種類というのは細胞透過性のあるもの（アセトキシメチルエステル体、AM）とそうでないもののことでしょうか。 うちのラボにあるものを使用しましたが、細胞透過性のないものを使いました。（おそらく論文のものと同一です） 引用先の論文も確認済みです。培地や血清の条件が記載されていましたがおおよそ合っていると思います。ただ、ラボにあるものと論文で使われているもののメーカーの違いについてはわかりません。確認してみます。 試薬メーカーのプロトコルは確認していませんでした。確認したいと思います。 Greenの洗浄工程は行っていないです。ただ参照がアセトキシメチルエステル体でのプロトコルなのでそうでないものでも必要なのでしょうか。考えてみます。 いろいろ意見をくださってありがとうございます。 ひとまずデータを上の方に報告して一旦相談してみます。

(無題) 削除/引用 No.3760-4 - 2015/01/21 (水) 12:00:47 - ~ 答えが分かる人が書き込んでくれればいいのですが、 それまでは、自分で1個ずつ確認していくしかないと思います。 １．試薬を間違えていませんよね？ 　　Calcium Green 5Nは2種類あるみたいですが、論文で使っている方を選べていますか？ ２．論文中のプロトコルはきちんと確認していますか？ 　プロトコルは引用していて、論文中ではbrieflyにしか書かれていませんよね。 　引用先まで確認していますか？ 　 ３．試薬メーカーの推奨プロトコルか確認していますか？ 　論文中で省略されている部分があるかは、試薬の説明書で確認することができるでしょう。 ここまで来て、1点気づいたのですが、 >蛍光光度計に懸濁液を加え、カルシウム指示薬を加えてdigitonin処理後、測定 はこの通りに処理しているのですよね？ ttps://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/mp03010.pdf では、 >4. Wash cells to remove excess probe that either has not been loaded or may be noncovalently associated with the membrane. This step is important when labeling with Calcium Orange™ and Calcium Crimson™, which are fluorescent prior to ester cleavage. と書かれていますが、Greenは洗浄工程は要らないのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3760-3 - 2015/01/21 (水) 01:24:10 - おお 細胞なしのネガコンもとってますか? バックグランドともいえますが。

(無題) 削除/引用 No.3760-2 - 2015/01/20 (火) 23:44:33 - おお >[Re:1] のすさんは書きました : > 操作は以下の通り行いました。 > →トリプシン処理により100mm dishから培養した細胞を剥がし、PBS(-)に懸濁 > ↓懸濁液を分取して細胞数をカウントし、遠心後測定用のmediumで懸濁 > ↓蛍光光度計に懸濁液を加え、カルシウム指示薬を加えてdigitonin処理後、測定 > トリプシン処理前にはPBS(-)で1回washしています。 > > 結果としては、CaCl2を加えてみてもまるで細胞が存在しないかのように反応がありません。 カルシウムをどこに入れているんですか。指示薬のはいった液にCa++をいれるとすべて反応してしまってるんじゃないかな。 培地に入れているなら、カルシウムイオノフォアなどでポジこんはとってますか?

細胞でのcalcium uptake assayについて 削除/引用 No.3760-1 - 2015/01/20 (火) 16:07:10 - のす 初投稿の学部生です。 細胞を数ヶ月前から扱い始め、現在細胞でのcalcium uptake assayを行っています。 しかし、カルシウムを細胞が取り込んでくれず困っています。 使用した細胞はHeLaです。 操作は以下の通り行いました。 →トリプシン処理により100mm dishから培養した細胞を剥がし、PBS(-)に懸濁 ↓懸濁液を分取して細胞数をカウントし、遠心後測定用のmediumで懸濁 ↓蛍光光度計に懸濁液を加え、カルシウム指示薬を加えてdigitonin処理後、測定 トリプシン処理前にはPBS(-)で1回washしています。 結果としては、CaCl2を加えてみてもまるで細胞が存在しないかのように反応がありません。 可能性としてはトリプシンを不活性化していないため細胞がダメージを受けてしまった・digitonin処理が上手くいっていない・細胞の状態が悪い・・・などを考えています。 細胞培養に関してはまだ慣れていないため、培養dish内で偏りが生じてしまい細胞の性質が変化してしまったことも考えられますが、全く反応を示さないほど変化してしまうものなのかと疑問に思っています。 操作の条件、試薬etcは「MICU1 encodes a mitochondrial EF hand protein required for Ca2+ uptake」という論文を参考にしています。 研究室でまだ前例が無いため、手探りの状態です。何かご助言いただけたらありがたいです。

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