BioTechnicalフォーラム [海外のプラスミドがリカバリー出来ません]

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(無題)

No.3774-5 - 2015/01/23 (金) 15:22:36 - 初学者

・様、いぬ様

コメントいただきありがとうございます。

はい、制限酵素カットする前と後とで比較しています。

オリジナルの方は3本un cutで出ているのが、cutによって一本になります。
こちらで形質転換したものに関しては、bandがオリジナルのサイズと全く異なり、また制限酵素カットしても一本にはなりません。

壊れているのでしょうか？
レトロウイルスベクターは不安定だと聞きますが、今回はまさにそれが原因でしょうか。

(無題)

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No.3774-4 - 2015/01/23 (金) 15:22:27 - おお

濃度は?
普通はうまくいくけど。

濃度が十分なら1回のtransformationは10ngぐらいで十分すぎるので、次のtransformationの時は薄めて使うことも可能。マイクログラムオーダーなら、100ngほど電気えいどうでながして確かめてみるのもて。まあ今どきの精製キットとかだとまず大丈夫だけど、ミニプレップで汚いのを水でとかした状態で分解という可能性もあるかもしれないので。DNAがちゃんときれいに精製されていて、TEなどDNaseのきかない溶液で解かしていたらまず大丈夫なはずです。まあきれいなDNAなら水でも大丈夫ですけど。酵素以外でそんな壊れるものではありません。

分解してたらまあだめだろうけど無理矢理ならポリメラーゼ、ligation処理でリカバーするかも。

溶液で運べばいいということですが、私なら万が一のことも考えてエタチンペレットで運びます。

ミニプレップが変だということがたまにあるんだよなぁ。。。もう数クローンふやして、違うキットつかうとか、きっとなしでやるとかしてみるのもいいかもしれない。
レトロウイルス用なので、リピートの配列がプラスみどを不安定化してるかもしれないということであればな、大腸菌の菌株や増やし方にきを配った方がいいし。

(無題)

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No.3774-3 - 2015/01/23 (金) 15:18:25 - いぬ

室温で1日放置したぐらいでおかしくなることはまずない。
ゲルも電圧も違うんだから泳動パターンも多少は変わるでしょ。

LBは選択培地ですよね？ネガコンとってますか？

(無題)

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No.3774-2 - 2015/01/23 (金) 15:06:00 - ・

まずは制限酵素で切断して泳動パターンを確認した方がいいのでは

海外のプラスミドがリカバリー出来ません

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No.3774-1 - 2015/01/23 (金) 14:58:25 - 初学者

室温させてください。
先月まで二ヶ月ほど海外に短期留学しておりました。そこで作製したレトロウイルス用プラスミドを日本に持ち帰る許可をいただき、帰国後DH5alphaに形質転換しましたが、目的のプラスミドを持った大腸菌が取れません。

コロニー自体はLBプレートに生え、10個ほどpickupしましたが、全てオリジナルのものとことなるバンドの出方でした。OC, CCCなど明らかに３種類以上のbandが出ています。

実は持ち帰る際、PCRチューブに1 ug/ulほどの原液のプラスミド(in TE)を 2 ulほど入れ、それを国内に持ち込みました。そのためプラスミドは約24 hrs室温に晒されたことになります。

向こうの方から、ろ紙よりもリカバリーの早いので液体で持って帰った方がいいよ、という助言に倣いました。またたった一日ですので室温でも問題ないとも言われました。

このような状況で目的のプラスミドをリカバリーする方法というのはないでしょうか？
向こうでもDH5alphaで、レトロウイルスベクターだからといって大腸菌のホストを変えるなどはしていませんでした。

2 ul持ち帰ったオリジナルの原液は残り1 ulです・・どうかご助言お願いします。

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