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(無題) 削除/引用 No.3805-10 - 2015/02/02 (月) 17:17:33 - AP >pET32bを用いたサンプルのところには >1つのバンドも見られませんでした。 これはつまりベクタープラスミドのバンドも見えなかったということですよね。 薬剤耐性で選択され、培養されたクローンからプラスミドが取れなかったという理解でいいですか？

(無題) 削除/引用 No.3805-9 - 2015/02/02 (月) 15:42:22 - おお DNAが検出されないなら、検出限界以下か、ないかだわ。まあ全部完全に検出限界以下というのもどうかと思うし、もしかしたらうっすら見えてるけど写真に撮れないほどの量ってこともあるので、その辺は本人の観察力次第。まあ念のため酵素で切る量を増やして流してみてもいいかもね。 あとはligationとかがうまくいってないとかあるかもしれないけど(NdeIとか条件次第ではほかの酵素より切れにくい酵素だし)、大腸菌が嫌うような配列を含むプラスみドになってしまったかもしれない。もしそうだと大腸菌にあまりストレスをかけないようにしたり、ヒートショックを37度でしてみたり(ケミカルのばあい)、プレートや培養液を30度ぐらいでふやしてみたりっていう方法はあるにはある。 とにかく入っている方のプラスミドでインサートの配列が確かめられた方から切り出して入れた方が効率がPCR products よりいいはずだから、それでやり直すのがいいかなと思う。

(無題) 削除/引用 No.3805-8 - 2015/02/02 (月) 14:06:20 - yyy なんか情報が足りないですね。 「コンピタントセルをligation productでtransformして、pET32bでもpET15bに遜色無い位の数のコロニーが生えてきた」ということで良いのでしょうか？ なのに「ミニプレップしても、pET15bでは出たのにpET32bではプラスミドらしきバンドが全く見られなかった」ということでしょうか？　 コントロールの空のベクターと言うのは「空ベクターで同時にtransformしたセル」から抽出したプラスミドですか？　それとも単に空ベクターを流しただけ、なのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3805-7 - 2015/02/02 (月) 13:54:56 - AP in vitroのライゲーション反応にハイコピーもローコピーもないでしょう？

(無題) 削除/引用 No.3805-6 - 2015/02/02 (月) 13:53:27 - AP いやいや、 精製後のプラスミド濃度なんかは、電気泳動で見るのに十分だったのかと、、

(無題) 削除/引用 No.3805-5 - 2015/02/02 (月) 13:48:04 - ken APさん お返事ありがとうございます pET15bでの構築はできているので ローコピーであるも考慮した割合での ライゲーションが行われていると考えます。

(無題) 削除/引用 No.3805-4 - 2015/02/02 (月) 13:22:13 - ken ぺーぺーさん 早速のお返事ありがとうございます インサート量や制限酵素、プライマーにつきましては pET15b、pET32bともに同じものを用いているので 条件としては同じはずなのですが...

(無題) 削除/引用 No.3805-3 - 2015/02/02 (月) 12:57:30 - AP pETがローコピーだということは考慮されていますか。 pUC, pBlueScriptなどのクローニングベクターに比べると細胞あたりのコピー数が1/20くらい、したがって収量も1/20くらいに下がります。

(無題) 削除/引用 No.3805-2 - 2015/02/02 (月) 12:51:57 - ぺーぺー すみません。いろいろ前提となる情報を持ち合わせていないのですが。 単にpET15bから切り出して、pET32bに挿入する方法で解決できるんですよね。簡単に思いつく原因がなければ、同じ問題が再発したときに考えれば良いのでは？ 簡単に思いつく原因の例： 　・なんかの設計ミスとか（制限酵素の選択、プライマーの設計）…… 　・pET32bの制限酵素処理が不十分だった 　・pET32bの脱リン酸化処理が不十分だった（あまり、ありそうにない） 　・インサートの制限酵素処理が不十分で極端に効率が落ちた 　・インサートが沢山入りすぎた

ライゲーションについてです。 削除/引用 No.3805-1 - 2015/02/02 (月) 12:24:23 - ken 酵素発現ベクターの構築のため、 目的遺伝子をPCRにて増幅させた後に 制限酵素　BamH�TとNde�Tで処理し pET15bとpET32bを用いてライゲーションを行いました。 コンピはDH5αを用いています。 しかしながらプラスミド抽出を行い 電気泳動にて確認を行った際に pET15bのみでしかバンドの確認はされませんでした。 どういった理由があるのでしょうか。 追記 コントロールとして流した空のベクターのバンドは現れましたが pET32bを用いたサンプルのところには 1つのバンドも見られませんでした。 ご教示の程よろしくお願いします。

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