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(無題) 削除/引用 No.3819-10 - 2015/02/05 (木) 12:17:57 - mnag AP様 確かに実験手順は一概ではなく 様々な手法が考えられますね。 恐らく私自身の手腕がまだ低次元であることも 考えた上でのプロトコになっているのだと思います。 TAを挟むことによってブルーホワイトでほぼ確実な コロニーをピックアップ出来るでしょうし..

(無題) 削除/引用 No.3819-9 - 2015/02/05 (木) 11:39:27 - AP 念のため言っておくと、書かれている手順が唯一無二の方法だとか、一番優れているだとかいう訳ではありません。 どのステップを確実にしたいか、何を重要視するか、費用対効果を同評価するか、などでとりうる手順は様々で、実験をデザインをする人の考え方ひとつです。 私なら、TA-cloningなんかしないで、 PCR ↓ プライマーに設計した制限酵素サイトで切る ↓ pETにligaton ↓ DH5alphaなどに形質転換、コロニーをスクリーニング。ここは、いきなりBL21(DE3)にしてはいけない。 形質転換効率があまり高くないし、recA-やendA-みたいなクローニングやプラスミド精製に有利な遺伝子を持っていない。なにより、BL21(DE3)でいきなりタンパク質が発現してしまうと（誘導をかけなくてもleaky expressionはゼロじゃない）大腸菌の生育に悪影響があるため、あたりのクローンこそコロニーが生えにくくなる。 ↓ あたりクローンのプラスミドのシークエンス確認 ↓ BL21(DE3)などに導入、タンパク質発現へ ですね。 あなたが指示された手順のココロを推測すると、 ・プライマーに設計した制限酵素サイトを切るのは案外、効率が悪くて失敗が多い。TAクローニングのほうがクローニング効率ははるかに良いのでそうしよう。 ・プライマリークローニングするのにはpETは向いていない。市販のT-Vectorがないし、low copy なのでプラスミドを精製して分析するのにも扱いづらい。ここは、市販のT-vectorでサクっとやってしまおう。 ・一旦、クローニングに成功したプラスミドからpETにリクローニングするのは割とたやすくて失敗が少ない。 わたしゃpETに入れなおしてからもう一度、シークエンスを確認したほうがいいと思いますがね。

(無題) 削除/引用 No.3819-8 - 2015/02/05 (木) 11:21:45 - mnag 多くの方の意見から TA-cloningはさほど必要ではなく しかし、確実な実験を行う上で 石橋を叩いて渡るの要領で行っている感じですね。 使う制限酵素がNde�Tなので私もTAをはさんで実験を行いたいと思います。 追記ですが 発現ベクターの構築の際にはトランスフォーメーションという 書き方はせずにDH5αを用いて構築を行う、とするべきでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3819-7 - 2015/02/05 (木) 11:13:43 - mnag 皆様 早朝から多くの意見ありがとうごがいます。 研究室の背景と致しまして 単離と遺伝子組に研究室内でテーマが 分かれています。先生をはじめ多くの先輩方が 単離をメインにやられている方で遺伝子や蛋白発現の 大まかな知識は有してますがなぜ行うかと突き詰めている プロフェッショナルな方がいない状態です。 (以前はポスドクの方がいらっしゃったのですが...) ですのでこちらで質問させて頂きました。

(無題) 削除/引用 No.3819-6 - 2015/02/05 (木) 09:12:24 - papa PCR断片を直接制限酵素処理後pETに移す方が普通でしょう． ただし，NdeIを用いる場合は，付加する余分な塩基（NEBなどに情報があります）を多くしても切れが悪い場合が多く，pETに入れられない場合があるので，一度TAクローニングしてからpETに載せ替えることが時々あります．

(無題) 削除/引用 No.3819-5 - 2015/02/05 (木) 08:53:28 - gel それぞれの過程の意義をちゃんと理解して実験を進めようとする姿勢は、最近キットが蔓延していて何も考えずに手を動かしている学生が多い中ですばらしいと思います。 ただ、個人的にはこういった基本的な疑問はラボの中で聞いた方が、いいんじゃないかな。 教える事も大切なことなので上の人のためにもなるし、研究室を円滑に運営するためにも情報交換という意味でのコミュニケーションは必要なことだと思うのです。 もし上の人がどうしようもない人で何も考えずに実験をしているような人ばかりなら、こちらで聞くのもいいでしょうけど。

(無題) 削除/引用 No.3819-4 - 2015/02/05 (木) 08:31:05 - Easy-A 別分野から移ってきたため、授業等でTA-cloningがなぜ必要なのかを教えてもらったことがありません。私も"模範回答"に興味があります。 自分が先輩から聞いたのは、PCRはエラーが入ることが多々ある。PCRをかけた後のチューブの中の溶液には、どこかにMutation(500bpのなかのうちの一塩基とか)が入ったPCR産物がまざっている可能性がある。こういうMutation入りの産物を発現vectorにつないでしまってはいかん。そこで、まずはPCR産物をTA-cloningし、シングルコロニーをピックしてそのシークエンスを調べてMutationが無いことを確認することが大事だということでした。 理屈でいえば、PCR産物を直接制限酵素処理した後に発現vectorに直接つないでも良さそうに思えます。実際、今現在ならクローニングにはproof reading enzymeを使うことが多いからMutationはそうそう入らないし、そもそもproof reading enzymeだとTA-cloningは出来ないことが多い(3'末端にAがつかない平滑末端になるものがほとんど)し。vector構築をよくやる方は、今もTA-cloningをはさんでやっている方が多いのでしょうか? 自分自身はproof readingでありながら末端にAがつくEasy-A enzymeを使ってTA-cloningをやってvector構築をしています。各ステップでうまくいっているかどうかを確認できるのが好きだからです。

(無題) 削除/引用 No.3819-3 - 2015/02/05 (木) 04:01:02 - おお べつにTAクローにんぐでなくって、pETのベクターにPCRfragmentsをクローニングしてもいいですが、クローにんぐのしやすさとか、くろーにんぐベクターをつかっえば、それ以外の実験でも使いやすいとかいろいろ事情があるかもしれません。 DH5αはK株、BL21（DE3）はB株でrestriction enzymeのシステムが違います。うーんこれでぴんと来て欲しいけど、、、説明めんどくさいから。

(無題) 削除/引用 No.3819-2 - 2015/02/05 (木) 03:49:42 - mnag pETベクターの構築としましたが 発現ベクターの構築でした。

TA-cloningについて 削除/引用 No.3819-1 - 2015/02/05 (木) 03:47:54 - mnag はじめまして 来季から研究室に配属になるものです。 目的タンパク質を発現させる際に PCR、TA-cloning（T-Vector pMD20、DH5α使用）、制限酵素処理 pETベクターでのライゲーション（pET15b、DH5α使用）を行った後に pETベクターをBL21（DE3）を用いてトランスフォーメーションを 行いIPTGの付加によりタンパク質を発現させる予定です。 この時、TA-cloning、pET15bとDH5α、pET15bとBL21（DE3） それぞれの操作を行う意義を教えてください。 特にpET15bとDH5αを用いる過程に関してはpETベクターの構築と説明を受けましたが なぜTA-cloningを行うのか、という点に関してアドバイスを いただければ幸いです。よろしくお願いします。

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