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おお様、AP様、有り難うございます。 削除/引用 No.3822-17 - 2015/02/18 (水) 14:59:01 - 大学院生です 大学院生です。 おお様、AP様、その節はどうも有り難うございました。 現在無事、変異の入ったプラスミドでのルシフェラーゼアッセイ継続中です。 さらにQ5site directed mutagenesis kitを用いての新たな変異ベクターを作成する予定ですが、こちらでご教示頂いた内容を踏まえて条件検討して行きたいと存じます。 なお、初回時、うまくいかなった（と勘違いしていた）LBプレートについてですが、最初37℃で一晩O/Nでincubateして、コロニーが生えなかったと考えた時点から室内に放置していました。 今度は用心して、予め室温でincubateするプレートと、37℃で48時間incubatするプレートと、2枚分準備しておこうと思います。 有り難うございました。

(無題) 削除/引用 No.3822-16 - 2015/02/13 (金) 21:33:02 - AP 単にコロニー形成が遅かったというだけでなく、プラスミドの毒性で37度では生えてこなくて、温度を下げたらコピー数の減少とか発現の低下とかで生えてきたのかも。37度では全く生えてこない形質転換体が室温だと生えてくるということがしばしばあります。

(無題) 削除/引用 No.3822-15 - 2015/02/13 (金) 14:07:30 - おお その大腸菌株は遅いんでしょうかね増殖が。まあ室温とかだとo/nではちょっと見つけれないこともあるかもしれません。

おお様、mon様、AP様有り難うございました。 削除/引用 No.3822-14 - 2015/02/13 (金) 13:16:25 - 大学院生です 先日当トピックにてご相談させて頂きました大学院生です。 その節は大変お世話になりました。 その後の経過をご報告申し上げます。大変お恥ずかしい限りの結果であり、匿名とはいえども、ご報告するのも躊躇われましたが、やはりご報告申し上げます。 結果からは、最初にトランスフォーメーションした大腸菌プレートから、48時間後にコロニーが生じて参りました。最初の投稿はseedしてから24時間目であり、その時コロニー0でしたので、以後はアルミホイルで包んで室温で放置していました。後日処分しようとしてアルミを開けてみたところ、ネガコン用に作成したプレートには何も生じていなかったのですが、それ以外のプレートには50個ずつ位コロニーが生じておりました。 それらを各プレート毎に20コロニーずつpick upしてグリセロールストックし、その後各4種ずつシークエンス作業を行ったところ、1種類は全部意図した通りの配列が組み込めており、もう一種類は1/4の確立でうまく出来ておりました。 そのため作成途中であった、2回目の変異ベクター作成作業は途中で凍結しました。 慌てすぎて結局2回目の試薬を無駄にした形になってしまい、大変反省しております。けれども、このトピックにご意見を寄せてくださったお三方の御陰で、大変勉強になりました。 本当に有り難うございました。

(無題) 削除/引用 No.3822-13 - 2015/02/07 (土) 12:54:23 - AP 自前で酵素を揃えてやるときは、PCR後の精製、ポリメラーゼの除去なんかをきっちりやりますが、KitではPCRでいらないバンドが生じなければ、特に何もせずに進めているようですね。ToyoboのKOD mutagenesis kitもそうです。 理屈から言えば、次のステップに校正活性のあるポリメラーゼを持ち込んじゃエクソ活性が悪さをする可能性があって良くないはずです。おそらくキットのデザインとしては、リン酸化やライゲーション反応が好熱性ポリメラーゼの至適温度よりかなり低いことや、たくさんの形質転換体が必要なわけではないので、多少効率が落ちても利便性をとるというふうになっているのでしょう。 キットでも、PCR後に精製をはさめば改善する可能性はあると思いますが、説明書通りにやってnothingというのは別に原因があるんじゃないでしょうか。節約もいいけれど、ビギナーは経験を積むことも大事だと思います。全く同じプロトコールで作業しても、ベテランはうまくいってビギナーは全然ダメ、でも失敗を繰り返すうちに、どこをどう変えたと言うわけでもなく、なぜかうまくいくようになる、と言うことはままあります。本来説明書に従ってキットを使えばうまくいように出来るはずで、ビギナーのうちは一度の失敗でうろたえて、あれこれやり方を変えてみるよりか、基本通りに出来るまで繰り返しチャレンジするのがいいかもなとも思います。 研究室の主宰者も教育に掛かるべきコストだと思って、大目に見て欲しいものです。 それと、最近の好熱性ポリメラーゼは性能が著しく良くなっているのか、説明書に書かれている反応条件例に、サイクル開始前のプレヒートが短かったりなかったり、ポストサイクルの伸長がなかったりするものもよく見るようになった気がします。一旦高温にさらされなければ活性がブロックされている、ホットスタートタイプの製品も普及して、価格も並になってきました。

皆様有り難うございます 削除/引用 No.3822-12 - 2015/02/07 (土) 11:18:37 - 大学院生です おお様、mon様、AP様、ご教示頂き、有り難うございます。 まとめての御礼となり、申し訳ございません。 こちらでの皆様のやりとりを拝見しているだけで、ものすごく良い勉強になります。（情けないことに、やりとりの内容についていくのもやっとの状態ですが） 皆様のご意見を参考に、再度チャレンジを行います。 また改めて経過報告させて頂きたいと存じますので、まだ解決ボタンは押さずにおいておきます。 本当に有り難うございました。

(無題) 削除/引用 No.3822-11 - 2015/02/07 (土) 10:39:37 - おお >[Re:10] monさんは書きました : > おおさんへ＞NEBのQ5酵素はDNA-binding domainが付加されているため伸長時間が短くてよい酵素です。 伸長が早いだろうなと思ってはいたんですが、そう言う仕組みがあったんですね。だたそれでも長めにとる方がいいのかなとおもって、書いてました。

(無題) 削除/引用 No.3822-10 - 2015/02/07 (土) 10:35:36 - mon >[Re:7] APさんは書きました : > （ligation前と後を比較してパターンが全然変わっていなかったら、ligaseが死んでいることが分かるくらい）。 これが分かれば十分。どこのstepが問題か見極めるためですから。 まったくコロニーがでないことから、DpnI消化不足による鋳型の残存はなさそうですね（抗生剤を間違えていなれば）。 なお、OCとlinearは並べて流せば違いは分かりますよ。 おおさんへ＞NEBのQ5酵素はDNA-binding domainが付加されているため伸長時間が短くてよい酵素です。 質問者さんへ＞最初PCRをかけて、それを10倍位に希釈して、同じプライマーで5cycleするで良いです。途中精製は不要でしょう。そのあと精製してください。要は元気の良いpolymeraseと十分な（かつ新鮮な？）基質で反応させ、末端を完全長にすることです。 kitの手順は知らないのですが、KLD反応はPCR反応液に直接試薬を添加して行うのでしたら、精製したらDNA溶液にPCR用bufferを添加しないと至適条件でないかも。

(無題) 削除/引用 No.3822-9 - 2015/02/07 (土) 06:26:07 - おお リン酸化で思い出しましたが、2本鎖じょうでブラントな状態のリン酸かはたしか効率が悪かったと思います。 その点について思いつく方法は、いちどdenatureしてからリン酸かすることもありかと思いますが、これはちょっと気持ち悪い。 もう一つの手はプライまーをあらかじめリン酸かしておくてがあります。リン酸か用のバッファーの持ち込みがありますから(Mgが10mMぐらいはいってるのではないかと)40-50倍希釈で使える程度ののうどでリン酸化するのがいいかとおもいます。まあ精製してもいいんでしょうけどちょっとめんどっちいので。 あるいはリン酸かされたやつを合成してもらって購入するてもありますが。

(無題) 削除/引用 No.3822-8 - 2015/02/07 (土) 03:29:26 - おお >[Re:3] 大学院生ですさんは書きました : > おお様、早速のご教示、有り難うございます。 > > 申し訳ございません。お勧め頂いた酵素は現在保有していません。（いざとなったら、上司にお願いして購入は可能とは思うのですが） まあキットの中身はそういうPCR enzyme (たぶんNEBだからphusion)とリン酸か酵素とDnpIとligaseでしょうから、、、バラで買うかキットで買うかに違いかと。。。 > > ＞それからPCRの酵素がDNAを削る作用があるので、PCR後何らかの精製をした方がベターという話もある。わたしは電気えいどうして切り出しをしてましたけどね > > 、このキットでもPCR後のサンプルを大量に作成して精製・濃縮しても大丈夫であれば、そのようにしたいと存じます。根拠のない素人考えですが、その方がstep2のKLDリアクション（リン酸化＋ライゲーション）の効率が上がるのではないかと思っておりまして・・・・。 まあ何ともいえないんですが、もくてきのDNAしか含まれないという確信のうえでやろうということです。リン酸かのステップをはしよって説明しましたが、認識していてよかったです。あと大量には必要ありません。あまり無理に増やすより(そうするといろいろなバックグランド的な反応もふえてくる)、電気えいどうしたりして、確認するに十分だと操作しやすいということです。電気えいどうで見えない量でもワークするはずのプロとコールです。 逆にテンプレートの量を100ngていどまでつり上げて、サイクル数を15回程度にしてもいいかもしれませんそのときはDpn I処理をしてから電気えいどうで確認しないと、テンプレートがかぶってわからないかもしれません(たしかほかの会社のきっとはそんなかんじにしてたとおもいます、ただ全く同じシステムかどうかわからないです)。 > > 目標のプラスミドのサイズは4.5kbであり、cycle中のextension時間は180sとしております。添付文書で書かれれているのよりも、余裕をもってみたつもりでした。けれども、最後のholding timeについては2分間のみでした。次回は、そこも延長してみたいと存じます。 Taqで1k、一分といわれています。長めにとるのはPCRのextensionがテンプレートの端っこまで届いているのを確実にするためで、そうでないfragmentができた場合、たいていは大丈夫ですけど、何か悪さをしてノンすぺをふやすとか、、、そんな危惧もないわけではないので、、、 あとPCR productsは大腸菌によるメチルかの修飾を受けてないので若干transformationの効率が低いかもしれません。それを補うプロとコールは今のところ見たことがないですが、、ヒートショック、on ice後SOBなどにいれてすぐに一部を直接プレートにまいてみてもいいかもしれません。とくにampなど静菌的な抗生物質であれば。 in vitroでmethylationをかますという方法もなきにしもあらずですけど、、、 ただメチレーションはそれが原因で全く取れないとは言い難いところでもありますので、そこの小手先の問題ではないかもしれません。あれこれやれることはありそうですが、無駄な苦労がふえるかもしれないと、、、 あ、それと、ligation の効率をあげるなら十数度でO/Nのほうがよいかと。またligationはselfが目的なのでDNA濃度がたかいと、selfでなく分子間のligationも増えますので、まあキットに書いてある量が最適になるようにしているのではと思いますが。self ligationのばあいは常識のはんいで薄ければ薄いほどいいでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.3822-7 - 2015/02/06 (金) 21:32:43 - AP ligation産物に含まれるのは、インプットのリニア断片、目的の環状化産物、自己環状化産物くらいの単純なものではないからね。 目的外の組合せのligation、その結果生じる様々な重合体、いろんなモノの混合物ですから。ligation産物を電気泳動しても得るところは少ないです（ligation前と後を比較してパターンが全然変わっていなかったら、ligaseが死んでいることが分かるくらい）。

(無題) 削除/引用 No.3822-6 - 2015/02/06 (金) 21:09:55 - AP ligationで環状化しても、スーパーコイルにはならないので、移動度では環状化していないリニアとほとんど区別がつかないと思う。 それよりなにより、ligation産物を電気泳動して、実際に環状化して形質転換能をもつ環状化DNAなんて微量過ぎて見えないと思う。見えるほどligation産物ができているなら、どんだけコロニーが生えるんだ？

mon様有り難うございます。 削除/引用 No.3822-5 - 2015/02/06 (金) 18:48:10 - 大学院生です mon様、早速のご教示有り難うございます。 ＞KLD反応はPCR産物の環状化だから、KLD反応後に目的サイズのバンドが見えるのは、ligationしていないと思います。PCR産物の末端が平滑でないからかな。PCRの増幅数が多すぎると末端まで伸長していない産物が多くなることがあるそうなので、おおさんの仰るようにするか、一旦増やしたものを10倍ほどに希釈して５回ほどサイクル回すとか。 よく考えれば、ご指摘の通りですよね（涙） 本日行ったポジコンサンプルのPCR産物も、KLD反応後のサンプルも保存していますので、こちらも電気泳動かけて確かめてみます。 宜しければ、「一旦増やしたものを10倍に希釈して5回ほどサイクルを回す」ところを詳しくお伺いしたいのですが。 最初PCRをかけて、その後PCR産物を電気泳動＋ゲル抽出して精製し、それを10倍位に希釈して、同じプライマーで5cycleする、という考え方であっていますでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3822-4 - 2015/02/06 (金) 18:27:13 - mon KLD反応はPCR産物の環状化だから、KLD反応後に目的サイズのバンドが見えるのは、ligationしていないと思います。 PCR産物の末端が平滑でないからかな。PCRの増幅数が多すぎると末端まで伸長していない産物が多くなることがあるそうなので、おおさんの仰るようにするか、一旦増やしたものを10倍ほどに希釈して５回ほどサイクル回すとか。

おお様、有り難うございます。 削除/引用 No.3822-3 - 2015/02/06 (金) 17:53:16 - 大学院生です おお様、早速のご教示、有り難うございます。 ＞PCRの条件を厳しくしてもいいかもしれない。 アニーリング温度を、出来るだけ高めの70℃としました。templateの量は22ngとしており、添付文書内の推奨template量（1-25ng）の中では少し多めにしておりました。 ＞これ単にinvertedでPCRしてるだけだから、手持ちのproofreading のそなわったPCR酵素(Pfuとかprime starとか)があったら、それでPCRかけてもいいよ。 申し訳ございません。お勧め頂いた酵素は現在保有していません。（いざとなったら、上司にお願いして購入は可能とは思うのですが） ＞それからPCRの酵素がDNAを削る作用があるので、PCR後何らかの精製をした方がベターという話もある。わたしは電気えいどうして切り出しをしてましたけどね ルシフェラーゼアッセイの為のベクターを作成する時、insertとする部分をPCR で増やした後、PCR産物をフェノクロ抽出＋エタ沈で濃縮＋制限酵素処理＋電気泳動・ゲル抽出＋もう一度エタ沈濃縮してからライゲーションする作業を行っていました。同じような感じに、このキットでもPCR後のサンプルを大量に作成して精製・濃縮しても大丈夫であれば、そのようにしたいと存じます。根拠のない素人考えですが、その方がstep2のKLDリアクション（リン酸化＋ライゲーション）の効率が上がるのではないかと思っておりまして・・・・。 ＞それから、プロとコール見るとプロとコールでいうfinal extensionが2分だけど、通常もうちょっと長めにとるんじゃないかな。また cycle中のextensionももう少し長めにとってもいいかもしれない。 目標のプラスミドのサイズは4.5kbであり、cycle中のextension時間は180sとしております。添付文書で書かれれているのよりも、余裕をもってみたつもりでした。けれども、最後のholding timeについては2分間のみでした。次回は、そこも延長してみたいと存じます。

(無題) 削除/引用 No.3822-2 - 2015/02/06 (金) 16:40:07 - おお PCRが問題のような気がするけど。。。かかってそうだけどあまりうまくかかってないというか。。。PCRの条件を厳しくしてもいいかもしれない。収量なんて50ngもあれば十分だから、かかるかかからんかぎりぎりくらいまで厳しくしてもいいかとおもう。あとは添加物加えるかどうかだが、、、そのキットのバッファーにすでに入っているかわからんとやりにくい。 これ単にinvertedでPCRしてるだけだから、手持ちのproofreading のそなわったPCR酵素(Pfuとかprime starとか)があったら、それでPCRかけてもいいよ。 そのあとのそうさもふつうの制限酵素しょりと、ligationだから、、、、まあわたしは、キットを使わないで同じ手法で作ったりしてましたけどね、、、 あ、それからPCRの酵素がDNAを削る作用があるので、PCR後何らかの精製をした方がベターという話もある。わたしは電気えいどうして切り出しをしてましたけどね、目に見えない程度のノンスペでも薬剤耐性マーカーとoriが入っていればtransformationでコロニーがでてきますから。 それから、プロとコール見るとプロとコールでいうfinal extensionが2分だけど、通常もうちょっと長めにとるんじゃないかな。また cycle中のextensionももう少し長めにとってもいいかもしれない。

Q5遺伝子変異導入キットについて教えて下さい 削除/引用 No.3822-1 - 2015/02/06 (金) 14:55:07 - 大学院生です こちらのサイトには常日頃よりお世話になっております。 現在、大学院生として、ルシフェラーゼアッセイにて、興味のある転写因子と特定遺伝子のプロモーター領域との関係を調べております。 今後、転写因子がくっつきそうな部分に変異をいれて、ルシフェラーゼアッセイを行いたいと考え、所属講座で保有しているNewEngland BioLaboのQ5 Site-Directed Mutagenesis Kit を用いての遺伝子の点変異導入を試みております。 まずは添付文書に書いてある通りの組成、量を用いて、付属の大腸菌に導入してみました。PCR反応後、KLDリアクションstepを過ぎた後、余ったサンプル5μl程をアガロースゲルで電気泳動したところ、予想通りの大きさのバンドが得られました。（この時同時に、同じプラスミド＋プライマーなしでPCR反応およびKLDリアクションを行ったサンプルを、ネガコンとして同時に電気泳動したところ、バンドは1本も現れませんでした。）しかし、キットに付属していた大腸菌コンピテントセルに導入し、プレートに播種したのですが、本日、一つもコロニーが育っていませんでした。 これに対し、キットに付属していたポジコン用のサンプルで、自分の手技に問題なかったのかどうか再チェックしております。（昨日同時にやっておけば良かったのですが、一回分が約1800円位する作業ですので、試薬をけちってしまいました） もしポジコンでもうまく育たなければ、自分の作業手順に問題ありと判断できます。しかし、ポジコンでうまく育ってきた場合は、どの辺りにトラブルの原因があると考えるべきでしょうか？ 添付文書のトラブルシューティングは読んだものの、プライマーの設計をサイトお勧めのソフトではなく、自分で行った事以外には思い当たりません。 もし同キットをお使いの方がいらっしゃいましたら、試薬節約や時間短縮のコツ、あるいは効率を上げるための事など、色々御教示頂ければ幸いと存じます。（キットを使用した経験のある方が身近にいないため、どうぞ宜しくお願い申し上げます）

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