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(無題) 削除/引用 No.3825-11 - 2015/02/08 (日) 10:58:41 - mon マイルドな不死化だと、p53を標的にしたshRNA遺伝子+hTERT遺伝子+c-myc(L-myc)かな？

(無題) 削除/引用 No.3825-10 - 2015/02/08 (日) 10:56:01 - mon もっとも不死化ベクターを作るなら、不死化細胞の利用法も考えておき不死化の手間（時間と形質check)を減らすことも考えておきましょう。長い時間をかけたけど、使えないがん化した細胞ばっかりができる可能性もありますよ。 例えば、SV40LTよりEBNA1の方が形質が残りやすいとか（両方試す）、hTERT遺伝子を（も）利用するとか、LoxPで挟んでおいて必要に応じて導入遺伝子を不活化できるようにしておくとか。そのような仕掛けのある（かつ薬剤耐性遺伝子も含まれている）レンチウィルスベクターを使うとか。

(無題) 削除/引用 No.3825-9 - 2015/02/08 (日) 10:40:20 - mon >[Re:7] SLTさんは書きました : > とするとテンプレートをこのプラスミドを使うよりは、HEK293TやCOSなどlarge Tでtransformした細胞からRNAを取り、そこから合成したcDNAをテンプレートに使った方がよいでしょうか？ いや、おおさんが提案しているように、plasmidを鋳型にしてexon部分のみを増やして連結すれば良いかと。これならPCRで変異が入る可能性もほとんどないでしょう。

(無題) 削除/引用 No.3825-8 - 2015/02/08 (日) 09:33:45 - おお LargTが入っているプラスミドがあるのに作るっていうのはまあいいけど、そのプラスミドのinsertが確認できればそれが使えると思うけど。

(無題) 削除/引用 No.3825-7 - 2015/02/08 (日) 08:16:30 - SLT monさんありがとうございます。 そうですね。PCRでその方も作られたのかもしれないですね。 とするとテンプレートをこのプラスミドを使うよりは、HEK293TやCOSなどlarge Tでtransformした細胞からRNAを取り、そこから合成したcDNAをテンプレートに使った方がよいでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3825-6 - 2015/02/08 (日) 08:05:45 - mon >[Re:5] SLTさんは書きました : > ただ気になる点は、DLKL以降のしばらく続く配列がpCDM8には見られないので、ゲノムが入っている可能性はありますね。調べてみます。ありがとうございます。 ならLargeT遺伝子が入ったSV40ゲノムの一部でしょう。おおさんのおっしゃるようにLargeTはスプライシングされると出来るタンパクです。最近はsmall Tが出来ないスプライシングされた状態(＝cDNA)を使うことが多いと思います。PCRで作れば？

(無題) 削除/引用 No.3825-5 - 2015/02/08 (日) 07:56:48 - SLT おおさま すみません、Small Tの間違いでした。 このプラスミドはpCDM8ベースのもので、Large T Agとラベルに書かれてありました。 シークエンスの結果を下に御示しします。 >EMBOSS_001_1 MDKVLNREESLQLMDLLGLERSAWGNIPLMRKAYLKKCKEFHPDKGGDEEKMKKMNTLYKKMEDGVKYAHQPDFGGFWDATEVFASSLNPGVDAIYCKQWPECAKKMSTNCICLLCLLRMKHENRKLYRKDPLVWVDCYCFDCFRMWFGLDLCEGTLLLWCDIIGQTTYRDLKL*GKYKIFKCIMC*TTDSNCLCILDSNLWN**MGAVVECL**GKPVLLRRNAI****GYC*LSTFYSSKKEEKGRRPQGLSFRIAKFF*VMLXLVIEXLGLLWLFXXXXXKXCXXXYKXXXXKKXSXTFXXRHNXXXSXXXXFXXTXXXXIXXXXXXXXXXKXXXXLXXXXXXXEXXXXXXXXX 最初のアスタリスクであるDLKLまでがsmall T Agのようです。 これ自身にはtransformする能力はないのですね。すみません調べていただいてしまって。 mapやref、ノートも残っていないようです。ボスも彼がどこでこれを使っていたのか、誰から貰ったものなのかも知らないようでした。 ただ気になる点は、DLKL以降のしばらく続く配列がpCDM8には見られないので、ゲノムが入っている可能性はありますね。調べてみます。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.3825-4 - 2015/02/08 (日) 07:44:05 - おお しかし、マップとかreferenceとかのこってないのかねぇ。。。確実な情報がないとなにやってるかわからないで実験しているようなものだし、、、

(無題) 削除/引用 No.3825-3 - 2015/02/08 (日) 06:58:21 - おお ttp://www.nature.com/onc/journal/v24/n52/full/1209046a.html Small Tというのもあって、それは自身はtransformation活性がないようです。それよりさらに削れた17K Tはどうでしょうかねぇ。。。

(無題) 削除/引用 No.3825-2 - 2015/02/07 (土) 16:44:43 - おお SV40のゲノムが入っていて、Large Tも発現するってことはないか? Large Tとshort Tかな、、、両者はsplicing isoformのようだし。 Large Tはp53とRbを不活化するけど、short Tだっけ、、、それにはなさそうだけど、、、

SV40 T抗原について 削除/引用 No.3825-1 - 2015/02/07 (土) 12:47:00 - SLT 前にいらっしゃった方のプラスミドリストを見て、「large T Ag」と書かれたチューブがありました。 ひょっとしてSV40 Large T抗原かな？と思い、シークエンスしたところ、SV40 short T抗原が入っていることが分かりました。 ttp://www.uniprot.org/uniprot/P03081 この174アミノ酸から成るSV40 short T抗原にもtransformする能力はあるのでしょうか？文献を調べてもlarge T抗原が使われています。 私自身が今、人プライマリー細胞を扱っており、不死化できたらなあと思っていまして、このT抗原が使えると非常に嬉しいのですが、皆様のご意見を伺いたくトピックを立てさせて頂きました。 どうか、教えてください。

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