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(無題) 削除/引用 No.3855-18 - 2015/02/13 (金) 23:29:32 - AP 例えば、 Dのプライマーを固定して、AB, AC, ADのジャンクションそれぞれにプライマーを設計する。うまくいけば、それらぷらいまーを同時に投入して同時に検出できるかも。

(無題) 削除/引用 No.3855-17 - 2015/02/13 (金) 23:25:28 - AP バリアントの量比を反映しなくてよく、あるかないかだけなら(今のやり方は上手くいったとしてもそうなりますが)、それぞれのバイアント固有のエクソンジャンクションをまたぐプライマーで個別に検出すれば良いとおもいます。ただし、プライマーの3'端は、二番目のエクソンにあまり食い込まないように。5'側がどのエクソンであれ、3'側の配列がある程度の長さマッチすればPCRがかかる可能性があります。

(無題) 削除/引用 No.3855-16 - 2015/02/13 (金) 18:00:13 - ~ 定性的に検出したいといっても、PCRの検出下限の話は残りますよね。 検出されなかったからといって、存在しないと結論付けてもいいのでしょうか？ A,Dのプライマーセットでバンドが確認されればいいのですが、 されなかった場合、それぞれのバリアントがどれくらいの濃度未満であったかの結論を出せるような基礎データを揃えるのは難しいでしょう。 直接的な解決法ではありませんが、PCR産物の検出感度を上げるために、 アガロースゲル電気泳動ではなく、PAGEで泳動するといいかもしれません。 アガロースゲル電気泳動でシングルバンドと思っていたサンプルを、 PAGEで流してみたところ、多数のバンドが検出されたことがありまして、 バンドがシャープになる分、検出感度が高くなるようです。 またエチブロではなくサイバーグリーン等の感度の高い染色試薬を使うのも有効でしょう。

(無題) 削除/引用 No.3855-15 - 2015/02/13 (金) 15:19:56 - おお まあわたしも半信半疑なところはありますが、High Resolution Meltingは最近かいはつされたものでSNPsの検出には有用性を発揮しています。50%であればまず検出できるということです。使われるdyeがポイントのようで、シャープなmelting curveがかけるようで、このようなことが可能になってきたようです。まあ将来性ということで示した文献のような定量性をあげているような説明もあります。 これもsaturationまでひっぱってPCRしてしまうと普通の電気えいどうでかくにんする欠点をそのまま引きずることになるので、、、いろいろ工夫が必要なのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3855-14 - 2015/02/13 (金) 15:01:28 - ABCD ぶっちゃけて書きますが、おおさんが紹介されている文献はどれ位信用できますかね？どのようなPCR産物にでも応用できるかどうかはわからないような。 まあそれはおいておいて、トピ主さんは定量には拘っておらず、存在を確かめるのが目的なんですよね？もう既にA、B、C、Dを発現する組織なり細胞なりは見つかっていて、それを別の組織か細胞でもみたいと言うことですか？ 私は似たような問題に当たったことがあります。その際、上司からはB、CでPCRをかけてうまくいったとしても、それでA、B、C、Dの並びのDNAが存在することを証明したことにはならないからな、と釘を刺されました。 私が試したのは以下の方法です。 1）A、DでPCRを行う 2）PCR産物をTAクローニングし、トランスフォーメンションしてLB plateにまく 3）インサートの外側に設計したプライマーでコロニーPCR 4）サイズが大きいバンドが出たコロニーを培養、ミニプレップ後にシークエンスに出す 結果、拾ったコロニーが300弱で、3個ほど当たり（A、B、C、D）が取れました。また、B'という新規のエキソンを発見することも出来ました。 その後、色々な細胞、組織でPCRをしたところ、A、B、C、Dのisoformを多量に発現している組織が見つかり、この組織ではA、DでPCRをすると二本のバンド（A、B、C、DとA、D）が出ることを発見しました。こっちを最初にやっておけば300のコロニーを拾う必要はなかったのになぜやらなかったかと思いました。 トピ主さんの場合でうまくいくかどうかはわかりませんが、一応参考までに。

(無題) 削除/引用 No.3855-13 - 2015/02/13 (金) 14:44:52 - おお ちなみにRIで量比を定量するときは200から300bpのような長さのものでも1minの伸長反応のコンディションでやってました。なるだけ両者で効率が変わらないように伸長が完結するまで反応させようということだと思います。

(無題) 削除/引用 No.3855-12 - 2015/02/13 (金) 14:40:31 - おお どのていど正確に発現量比を出さないといけないのでしょうか。たとえば、コントロールとの比較でどのisoformの割合が上がっているとかそんなものでいいのかどうか、、、

(無題) 削除/引用 No.3855-11 - 2015/02/13 (金) 14:01:37 - おお プライまーが非常によいものが作れたならば、AとCでプライまーを設定して、リアルタイム PCRで増幅後、メルティングカーブでラフではありますがある程度の割合なら両者のproductsを検出して量比が見れるそうです。melting pointが離れていればレンジもひろくなるかもしれません。 http://www.innofoodsee.eu/downloads/idj_mozzarella.pdf 存在比を調べる方法はいろいろありますが、RNA protection assayであればかなり直接的にみれます。 あとはPCRの初期の立ち上がって間もないところでは比較的定量性があるのでそこで検出するというのもやられています。ただそのレンジでは蛍光色素では検出が困難かできないので、RIをつかってphosphoimagerなどで定量しているようです。RIが使えないならPCRサザンでも何とかなるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3855-10 - 2015/02/13 (金) 13:25:32 - PCR すいません、ちょっと補足で疑問が出てきましたので…. B,Cにプライマーを設計するのは良いですが、 この方法だとA,D間のフォームを検出するとき、 やはり短いフォームが優先されて増えてしまいますよね….. たとえばDの後のE,F,G（この間にはスプライシングはありません） にプライマーを設計して産物の長さを長くする、という方法では如何でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3855-9 - 2015/02/13 (金) 13:16:25 - PCR ありがとうございます。 皆様のアドバイスはこちらの現場では得られない、本当に貴重なものです。 今回の目的は存在の有無を明らかにすることなので、 定量目的ではありません。 としますと、 B領域、C領域にプライマーを設定する方法でやってみようと思います。 同一プライマーで一度に複数バンドが得られれば、最も効率的かと試したのですが…. 同じ産物間でも増幅効率が異なってくるのですね…非常に勉強になりました。

(無題) 削除/引用 No.3855-8 - 2015/02/13 (金) 13:08:22 - AP >優先的に増えるのは当たり前です。 何か間違っていますか？

(無題) 削除/引用 No.3855-7 - 2015/02/13 (金) 12:55:22 - 774R >産物の長さはそれぞれ約100,200,300bpです。 そのくらい短く産物なら、多少バイアスがかかっても300bpが全く増えないということは無いと思いますよ。 もともとのcDNA中のバリアントの存在比として、短い奴のほうが多いという可能性が考えられます。 ただし、傾向として短い産物が優先的に増えることは間違いないので、その実験方法で存在比を議論するのは不十分だと思います。 存在比を詳しく調べたいなら、やっぱりリアルタイムPCRかなぁ・・・

バリアント検出の目的は？？？ 削除/引用 No.3855-6 - 2015/02/13 (金) 12:52:31 - 774R バリアントの検出を行なってるそうですが、そのような方法でやっても定量性は全く保証されません。 バリアントの存在比を比較するのは無意味ですが、バリアントが存在するかどうかだけが分かればよいのでしたら、B領域やC領域にプライマーを設定すればよいでしょう。（ただし、量的な議論は出来ませんのでご注意を。） 存在比を検討したいのであれば、それぞれの領域を対象にリアルタイムPCRをやるのが妥当かなと思います。 また、もし長いタイプのアイソフォームをクローニングしたいという目的でしたら、出来るだけロングPCRに適した酵素を使い、十分な伸長時間を与えることでしょう。それでもダメならA-C間とC-D間を別々にPCRして、後で制限酵素等で結合する方法がよいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.3855-5 - 2015/02/13 (金) 12:33:23 - PCR 皆様ありがとうございます。 産物の長さはそれぞれ約100,200,300bpです。 競合により、最短のバリアントがドミナントになってしまう可能性については、 アニーリングの時間を長くしてもあまり効果はないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3855-4 - 2015/02/13 (金) 12:27:48 - おお >[Re:3] APさんは書きました : > 同じプライマーで長さの異なる標的を同時にPCRしたら、競合が起こって増えやすい（短い）のが優先的に増えるのは当たり前です。 それは増やす長さにもよるのでは。ある程度条件によって改善できるとも思うんですが。

(無題) 削除/引用 No.3855-3 - 2015/02/13 (金) 12:20:43 - AP 同じプライマーで長さの異なる標的を同時にPCRしたら、競合が起こって増えやすい（短い）のが優先的に増えるのは当たり前です。

(無題) 削除/引用 No.3855-2 - 2015/02/13 (金) 12:19:59 - おお >[Re:1] PCRさんは書きました : > PCRでスプライシングを起こしたバリアントの検出をしています。 > エクソンを順番にA,B,C,D….としていくと、 > A,B,C,D > A,C,D > A,D > こんな感じです。 > > ここでA,Dにプライマーを設計すると、長さの異なる複数のバンドが得られるはずなのですが、 > 最短の産物(A,D)が増え、長いフォームは40サイクル回してもやっと見えるか、見えないかという状態です。 それがもし発現量を反映しているなら、そう言うもんだと思うし、何が問題なんでしょうか。伸長反応時間を伸ばすともしかしたら若干ましになるかもしれません。 non-RIでいいからPCRサザンすると蛍光で検出するより感度をあげることができます。 productsの長さによっては最近の改良されたPCR酵素などの方がバッチリ見えるかもしれません。タカラだとprime starとか。NEBのphusionともう一ついいのがあるようですが。

バリアントの検出 削除/引用 No.3855-1 - 2015/02/13 (金) 11:49:19 - PCR お世話になっております。 どうかお知恵をお貸しください。 PCRでスプライシングを起こしたバリアントの検出をしています。 エクソンを順番にA,B,C,D….としていくと、 A,B,C,D A,C,D A,D こんな感じです。 ここでA,Dにプライマーを設計すると、長さの異なる複数のバンドが得られるはずなのですが、 最短の産物(A,D)が増え、長いフォームは40サイクル回してもやっと見えるか、見えないかという状態です。 酵素はex taqを使い、アニーリングは30秒、伸長反応は45秒です。 似たようなご経験をお持ちでしたら、是非お聞かせください。 お願いいたします。

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