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(無題) 削除/引用 No.3871-29 - 2015/02/20 (金) 02:50:44 - yama おおさん、APさん＞ ありがとうございます。残念ながら抽出RNAを今回は使い切ってしまったので、さらなる精製はできないですが、次回同じような状況に遭遇した場合は試してみようと思います。 メラトニンはPCR阻害物質なのですね。今回は、詳細はあまり公開できませんが、子宮のprimary細胞を使用しています。

(無題) 削除/引用 No.3871-28 - 2015/02/20 (金) 02:40:15 - おお >わたしもAPさんと同じようなことをかんがえていました。 でも書き込まなかったのは、それが改善策になるかというてんでは、示された例で改善できるのかどうか経験がないので、同じようなシチュエーションで改善された方のコメントのほうが説得力があるだろうと思った次第です。 夾雑物を除くには同じ方法を繰り返さずとも、違う方法でさらに精製をするとかいくらか手がありますが、やはりそれぞれの方法、除ける夾雑物と除けない夾雑物がありますので、、、 ちなみに公開できる範囲で、どの様な細胞をつかったのか示せるなら、しめしてはどうでしょうか。たとえばメラニンはPCR阻害物質として有名ですし、細胞独特のものが関与しているかもしれませんので。ただ私が答えれるわけではないですけど、、、

(無題) 削除/引用 No.3871-27 - 2015/02/19 (木) 22:47:29 - おお >[Re:23] APさんは書きました : > インプット量を増やさざるを得ないなら、もう1ラウンド精製をかませて夾雑物を減らすといいかもしれません。 わたしもAPさんと同じようなことをかんがえていました。RNAをそのキットのlysis bufferと混ぜ(直感的にvolumeで5倍以上のlysis buffer)、カラムに載せて最初の精製と同等の作業をするということです。

(無題) 削除/引用 No.3871-26 - 2015/02/19 (木) 18:51:24 - yama qWさん＞確かに２ｍMは高濃度だと思っていますが、細胞種は異なりますが、いくつかの論文で使用されていた濃度なのですよね。細胞自体は、特に死滅することなく、特に大きな形態変化もなく生えていたので、問題なく培養できていたと考えておりました。

(無題) 削除/引用 No.3871-25 - 2015/02/19 (木) 18:19:42 - qw 2mM バルプロ酸は、HDACを殆ど完全に抑えそうな気がするのだけど、本当に”細胞が問題なく培養できています”なのですか？ 細胞におおきな問題がある可能性を疑ってしまいますが、気のせいでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3871-24 - 2015/02/19 (木) 17:44:42 - yama triさん＞ やはりRNAが取れないご経験あるのですね。私の場合、vortexに加え、23G針でピペッティングしていたので、十分かと思っていました。今回ももしかしたらバルプロ酸の影響で細胞の性格がかわってしまい、何らかの理由でとれなくなったのかもしれません。 APさん＞わかりやすいご説明ありがとうございます。totalのRNA量さえそろっていればいいのかと思っていました。勉強になりました。もう１ラウンドの精製というのはどのような手順でしょうか？ 皆様ほかにもRNA kitを使用したのにRNA回収できなかったなどご経験ありましたら教えてください。

(無題) 削除/引用 No.3871-23 - 2015/02/19 (木) 16:42:17 - AP インプット量を増やさざるを得ないなら、もう1ラウンド精製をかませて夾雑物を減らすといいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3871-22 - 2015/02/19 (木) 16:41:59 - tri RNeasy kitを使っていますが、時々RNAを回収できない事は経験しています。 今回のように傾向があるわけではないのですが、細胞密度が多かったり凝集したりしているとうまく取れない印象です。 このキットの場合、最初に細胞をちゃんと溶解できるかがRNAの回収量にかなり影響するので、細胞のホモジェナイズの方法を変えてみると改善するかもしれません。 また、廃液が面倒になりますが、フェノール系の試薬を使うAGPC法の方が経験上安定して抽出できるように感じます。

(無題) 削除/引用 No.3871-21 - 2015/02/19 (木) 16:29:51 - AP 測定値から濃度を調整したうえで、電気泳動しているのですね。 収量に極端に差がある場合、対象物の量だけそろえりゃいいやと、収量の低いサンプルのインプットを多くすると、持ち込み夾雑物の濃度あがるのでサンプル間で反応系が同等に働かなくなるということはよく有ります。 サンプル濃度（サンプルのインプット量）を反応が線形であると思い込んではいけません。

(無題) 削除/引用 No.3871-20 - 2015/02/19 (木) 15:07:12 - yama おおさん＞説明が悪くてすみませんでした。 control（バルプロ酸投与なし）のRNA濃度は、500ng/ul。一方、バルプロ酸投与ありの検体は、90ng/ulでしたので、約3〜4倍の差でした。 RTには、0.5ugを供しました。

(無題) 削除/引用 No.3871-19 - 2015/02/19 (木) 14:46:53 - おお ああ、やっと状況がわかった。収量が少ないぶんcontrolに比べてvolumeを増やさないといけないのでRNAに対する夾雑物のようは多いはずですよね。。。収量にどれぐらい差がありますか?

(無題) 削除/引用 No.3871-18 - 2015/02/19 (木) 14:14:02 - yama APさん＞ ありがとうございます。濃度は吸光度による測定です。picogreenなどの蛍光色素による定量も試みたいところですが、残念ながら今てもとにありません。 おっしゃるように、 濃度測定結果と泳動結果は一致する（吸光度で出たから総RNA量を合わせて泳動して、同じバンドの濃さだったため） しかし、 �@採取されるべきRNAの量が極端に少ない �A18SRNA、GAPDHはPCRでかかってこない。 という二つの問題点があるということです。 �@は仕方なかった（細胞の状態が見かけ以上にわるかったなど・・）としても、�Aのところがなぜかわからないです。RT試薬をやりかえてみようかとも思います。ただ、同じときにRTをおこなった検体はうまくかかっていますので、それも原因の可能性はすくないかと思っています。

(無題) 削除/引用 No.3871-17 - 2015/02/19 (木) 14:11:30 - おお APさん、実際の濃度を測ってるんだか、、、ってGAPDHでのqPCRで測定ってかいてますから、、、吸光度などで測ってるんですかね。まあ蛍光色素でもいいですけど。

(無題) 削除/引用 No.3871-16 - 2015/02/19 (木) 13:46:58 - AP >RNA濃度（濃度がほとんど測定閾値以下です） rRNAのバンドはコントロールと変わらない強度だということと矛盾しますね。 精製したtotal RNAは99 %ちかくrRNAで占められているはずですから、測定値もそれなりのはず。 吸光度ですか？何か干渉物質があるのか？ picogreenなどの蛍光色素による定量ならば？

(無題) 削除/引用 No.3871-15 - 2015/02/19 (木) 13:02:38 - おお >[Re:8] yamaさんは書きました : > ちなみに、泳動したところ、１８Sと２８Sはきれいバンドがでました。 > 不思議なことに、RNAがきちんと取れていると思われる検体と同じ濃さのバンドです。ということは、rRNAはきちんとふくまれているが、ｍRNAがうまくとれてないということかと思われます。 mRNAだけうまく取れないってことはないと思いますが、、、 なんかの持ち込みでRTかPCRに阻害がかかっているようなきがしますね。

(無題) 削除/引用 No.3871-14 - 2015/02/19 (木) 13:01:25 - yama 又三郎さん＞ ありがとうございます。そうですね、原因は不明ですがそうだとしか考えられないですね。あとは、バルプロ酸投与群では、細胞がしっかりあったはずなのに、回収RNA量が極端にすくなかったのがなぜか分からないです。 いずれにしろ、原因は不明です。バルプロ酸の濃度などを調整するしか解決策はないような気がします。

(無題) 削除/引用 No.3871-13 - 2015/02/19 (木) 12:41:11 - 又三郎 電気泳動で検出されている18S rRNAもPCRで増幅されないということは、バルプロ酸投与群ではなんらかの物質によりRTやPCRが阻害されているんじゃありませんか?

(無題) 削除/引用 No.3871-12 - 2015/02/19 (木) 12:35:10 - yama 一度18S rRNAをPCRしてみてはいかがですか？ 又三郎さん＞試してみましたが18SrRNAも、GAPDHと同様、バルプロ酸処理検体ではうまく検出されませんでした。

(無題) 削除/引用 No.3871-11 - 2015/02/19 (木) 09:05:30 - 又三郎 一度18S rRNAをPCRしてみてはいかがですか？

(無題) 削除/引用 No.3871-10 - 2015/02/19 (木) 06:25:48 - yama ありがとうございます。 おっしゃるご意見も考えましたが、GAPDHにかぎらずほかの遺伝子たちも同様に立ち上がってきませんでした。なので、GAPDHに限ったこともないように思えます。何よりも、RNA濃度が激減してしまうところに疑問を感じております。

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