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タンパク質間の架橋および脱架橋 トピック削除
No.3876-TOPIC - 2015/02/20 (金) 13:15:18 - 遊chem
特定のタンパク質間（例えばタンパクAとタンパクBの)相互作用を確認したいのですが、恐らく流動性が高い為なのかあるいは、相互作用自体がないのかIP/IB（タンパクA→IP タンパクB→IB）ではタンパク質間の相互作用が見えませんでした。

そこで、偽陽性など問題があるとは思いますが、相互作用の有無があるのか
次のような方法で確認してみようと思います。現実性はあるでしょうか？

ChIPの手法を使いDNA断片とタンパク質複合体をIPして、そしてクロスリンクを外す
その試料をWBすることにより、上での例のタンパクBの有無を見る。

ChIPの手法を使いたいのはDNA上での特定の複合体にあるタンパク質が相互作用しているのか見たい為です。

問題は
タンパク質間のクロスリンクの脱架橋は適切に行うことが可能なのか？
タンパク質の壊れ方は許容範囲内で抑えられる場合があるのか？
（つまりは、WBでタンパクBを検出ができるのか？）

アドバイスをよろしくお願いいたします。
　
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No.3876-6 - 2015/02/21 (土) 14:56:53 - 遊chem
おおさん、参考文献さん、独り言さん
情報ありがとうございました。
DSP、DTTなどそのような実験用に適切に設計された架橋剤が存在するのですね。
調べが至っていませんでした。
紹介論文も参考にやり方を検討したいと思います。

本当に、ありがとうございました。

(無題) 削除/引用
No.3876-5 - 2015/02/20 (金) 19:52:20 - 独り言
DSPならよく使われているような気がするけど。S-Sがはいっているから、IP後に普通のSample bufferで外れます。

(無題) 削除/引用
No.3876-4 - 2015/02/20 (金) 17:56:19 - 参考文献
この文献が参考になりますか？
Optimization of Formaldehyde Cross-Linking for Protein Interaction Analysis of Non-Tagged Integrin 1

PubMed ID: 20634879

(無題) 削除/引用
No.3876-3 - 2015/02/20 (金) 14:47:26 - おお
偽陽性の可能性は確かに完全に排除できませんが、一応関係なさそうな核タンパク質とかGFPとかで核で発現しているならそう言うものをつかってランダムに架橋がおこっているわけではないことはしめせるとおもいます。

あとはほかの実験とのコンビネーションで結果がconsistentであるかなどで判断していくといいでしょう。

(無題) 削除/引用
No.3876-2 - 2015/02/20 (金) 14:39:35 - おお
クロスリンクは一般的にはたらきます。じっさいフォルムアルデヒドでタンパク間のクロスリンクをしたことがあります。ただ脱架橋は難しいと私はおもいます。Chipのほうほうでは脱架橋のステップがあるのですが、どこまで効いているのか私も知りたいと思うぐらいです。

なのでAでIPして、WBしてBで検出して、バンドのサイズがA+Bのあたりの場所に来るとか、サイズを確認しながらcomplexの具合をさぐるまたは考察することになります。いずれにせよChipの方法は一度変させるので、AでIPしたものはAを含むcomplexで蛋白間の架橋が成立したものが取れてくるわけで、そこにBがあるならもとのcomplex中にBがあったと解釈できます。

たとえばBaxだったと思いますが、この蛋白はミトコンドリアでmultimerになり、その様子をグルタルアルデヒドで架橋して分子量が2倍になるとかそういったのをみた実験がpublishされています。

架橋剤はほかにも蛋白研究ようにつかわれるそれに特化したようなものもあります。なかには架橋剤の内部にS-Sをしくんだものもありクロスリンク後DTTなどで外せるようになっているものもあります。

タンパク質間の架橋および脱架橋 削除/引用
No.3876-1 - 2015/02/20 (金) 13:15:18 - 遊chem
特定のタンパク質間（例えばタンパクAとタンパクBの)相互作用を確認したいのですが、恐らく流動性が高い為なのかあるいは、相互作用自体がないのかIP/IB（タンパクA→IP タンパクB→IB）ではタンパク質間の相互作用が見えませんでした。

そこで、偽陽性など問題があるとは思いますが、相互作用の有無があるのか
次のような方法で確認してみようと思います。現実性はあるでしょうか？

ChIPの手法を使いDNA断片とタンパク質複合体をIPして、そしてクロスリンクを外す
その試料をWBすることにより、上での例のタンパクBの有無を見る。

ChIPの手法を使いたいのはDNA上での特定の複合体にあるタンパク質が相互作用しているのか見たい為です。

問題は
タンパク質間のクロスリンクの脱架橋は適切に行うことが可能なのか？
タンパク質の壊れ方は許容範囲内で抑えられる場合があるのか？
（つまりは、WBでタンパクBを検出ができるのか？）

アドバイスをよろしくお願いいたします。
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