BioTechnicalフォーラム [pET16bを用いたクローニングについて]

pET16bを用いたクローニングについて

No.3892-TOPIC - 2015/02/25 (水) 15:14:16 - tora

質問です。
今回pET16bを用いて、タンパクの発現を行おうと思うのですが、
インサートを挿入するときに、マルチクローニングサイト(MCS)外にある
制限酵素サイトを用いて挿入し、発現させることは可能ですか。
今回用いる制限酵素は、都合上NdeIとHindⅢを使いたいのですが、
NdeIはMCS内で、HindⅢはMCS外にあります。ベクターマップを見る限り、
T7terminator配列を削ることにはなりますが、他の遺伝子には影響がないように思います。T7terminator配列は無くても、タンパク発現にはあまり影響がないと書いてありましたが、心配です。
同じような経験があれば、アドバイスお願いします。
　

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No.3892-11 - 2015/02/26 (木) 15:55:55 - mon

insertのHindIIIとベクターのXhoIをfill-inして（正しく）ligationされた場合、HindIIIサイトが再生されますよ。

(無題)

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No.3892-10 - 2015/02/26 (木) 08:42:13 - tora

皆様アドバイスありがとうございました。
おっしゃる通りまずはMCSを利用する方法で
やってみようと思います。

(無題)

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No.3892-9 - 2015/02/26 (木) 05:30:56 - おお

>NdeI以外の方を平滑化すればXhoIでもBamHIでも使えるし、またXhoIで処理したベクターをTCGで埋めて、HindIIIで処理したインサートをAGCで埋めた後でNdeIで処理すれば両方突出末端でライゲーションできます。

まずこのストラテジーを理解されていらっしゃらないように感じる。

>pET16bには、NdeIのサイトもHindⅢのサイトも存在しているので、
>末端の平滑化は必要でないと考えています。

それは違うでしょう。HindIIIサイトを利用したいか、利用して意図するものができるかが先じゃないですか?

必ずしも高発現がさせたほうがいいわけでもないので、terminatorをけずって思わぬ効果があるかもしれませんが、下流をずっと見ていってstopの位置ぐらいは確認しなさい。

いっそのことterminator削るものと、けずらずMCSにinsertするのと両方作ってみてはどうですか?

(無題)

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No.3892-8 - 2015/02/26 (木) 02:57:17 - おお

はつげんするでしょう。ただ一般的にやる方法でもないので、比較、感触を持っている人は少ないのではないかと。よくわからない部分が大きいそう言う方法でやるより、MCSで片方だけブラントで、5'側をNdeIでligationでいいとおもいますが。そんなに難しい方法でもないとおもいますし。

あとSTOPの位置はなるだけ発現したい配列のC末から近い方がいいよ。実験によるけど、何か比較したいものがある場合、付加された部分をそろえる方が結論を出しやすい。いっそうのこと入れたい配列の直後にstopおくほうがすっきりする。C末のタグをどうするかにもよるけど。

(無題)

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No.3892-7 - 2015/02/25 (水) 18:07:34 - mon

発現はするでしょう。
しかし、aさんが指摘しているようにトラブルになる可能性がありますし、その場合のトラブル回避は、結局コンストラクトを作り直すしかありません。
そうでなくても異種での大量タンパク発現は難しい事が多いので、わざわざトラブルの原因を増やすことはお勧めしません。数ヶ月無駄にするかもしれませんよ。
万人が行っているようにT7promoterとT7terminatorの間に挟むのが無難です。

(無題)

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No.3892-6 - 2015/02/25 (水) 16:08:10 - tora

アドバイスありがとうございます。
質問している立場で申し訳ないのですが、
pET16bには、NdeIのサイトもHindⅢのサイトも存在しているので、
末端の平滑化は必要でないと考えています。インサートにも同じように制限酵素サイトをつけているので、そのままライゲーションも可能だと思います。
私が気になっているのは、単純に言うと、MCS外にインサートを挿入しても、タンパクの発現が可能かどうかということです。
もちろんインサートはT7プロモーター下流に挿入し、その間に終止コドンやT7terminatorはありません。まだまだ始めたばかりで、的を射ない質問かもしれませんが、アドバイスお願いします。

(無題)

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No.3892-5 - 2015/02/25 (水) 15:36:36 - a

ああ、何度もすみません。
HindIIIはAGCで大丈夫でした。
すみません…

(無題)

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No.3892-4 - 2015/02/25 (水) 15:35:18 - a

あ、間違えました。
HindIIIもTCGで埋めますね。

(無題)

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No.3892-3 - 2015/02/25 (水) 15:34:08 - a

マニュアルを抜粋すると下記のように書いてます。

「ほとんどのタンパク質の効率的な発現にはターミネーターは必要ありませんが、クローニングの際T7転写ターミネーターが除去されてしまうとT7 RNAポリメラーゼによる高効率な読み過ごし転写 (read-through transcription)のため目的タンパク質とともにIPTG依存的なbeta-ラクタマーゼ
(Mr 31.5 kDa)の蓄積が観察されます」
「ampR pETベクターで目的mRNAとともに産生されるbla mRNAとの翻訳開始の競合が考えられます.Tφは,この競合 mRNAの量を低減させるため目的タンパク質の産生量を増大します」

beta-lactamaseの蓄積による耐性を持たない菌の増殖と、ターミネーターによる発現の増大の可能性があるので、ターミネーターがなくても発現するけどあったほうが発現量があがるかもしれない、くらいの感じだと思います。

NdeI以外の方を平滑化すればXhoIでもBamHIでも使えるし、またXhoIで処理したベクターをTCGで埋めて、HindIIIで処理したインサートをAGCで埋めた後でNdeIで処理すれば両方突出末端でライゲーションできます。

(無題)

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No.3892-2 - 2015/02/25 (水) 15:28:56 - mon

3'側をbluntingしてはいかがですか。
例えば、
(i)NEB#4＋BSA（あるいはCutSmart)＋MCS内の酵素（InsertはHindIIIかな？）で切断、
(ii)dNTP 0.1mM+T4 DNA polymerase (10U)を加え,22-25℃ 15分平滑末端化、65℃ 15分でpolymeraseを失活。
(iii)NdeIを加え切断。
とか。

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No.3892-1 - 2015/02/25 (水) 15:14:16 - tora

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