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(無題) 削除/引用 No.3903-17 - 2015/03/01 (日) 09:28:16 - mon > プライミングの効率を上げるというのがやっぱりいいんですね。 > 具体的には、プライマー濃度を上げる、プライミング温度までゆっくり温度を下げていく、の他にどのような方法があるでしょうか？ どのようなプライマーを想定しているのか不明ですが、伸長時間を非常に長くする＝primingの機会を増やす、ことも有効だと思います。短いプライマーの場合は、伸長温度をアニーリング温度に近づける（「程よく」下げる）ことが必要かもしれません。 質問者さんの目的と望みの結果がイマイチ分からないナ。予想していたものと違うようだし。

(無題) 削除/引用 No.3903-16 - 2015/02/28 (土) 16:17:27 - 特命希望 そもそも通常のPCRの効率がほぼ１００％であれば、普通に１サイクル回せば良いと思います。誰かPCRの効率に関する論文（特にPCR初期の効率が詳しく解析されているのがベター）を知っていたら情報提供して下さい。

(無題) 削除/引用 No.3903-15 - 2015/02/28 (土) 15:22:14 - おお >[Re:10] manaさんは書きました : > みなさん　ありがとうございます。 > > プライミングの効率を上げるというのがやっぱりいいんですね。 > 具体的には、プライマー濃度を上げる、プライミング温度までゆっくり温度を下げていく、の他にどのような方法があるでしょうか？ > > single stranded binding proteinなどを使う方法も良さそうですがプライミング効率を論じている論文が見つからないので効果がわかりません。 > > てか評価方法はもっているのかな?

(無題) 削除/引用 No.3903-14 - 2015/02/28 (土) 15:20:40 - おお あまり細かいことは考えないで、ビーズかなんかにプライまーを固定してアニーリング後にビーズを回収して回収の時にのぞいた溶液にテンプレートが残っているかで評価したらどう?プライまーが大過剰になるようにピーズを加えると100%にかなり近くなるでしょうし。

Re: 削除/引用 No.3903-13 - 2015/02/28 (土) 15:14:18 - UC みなさん同様、いまいち目的が見えてきませんが、「テンプレートDNA」とはgenomic DNAとは別なんですかね。ゲノムであれば、全ゲノム増幅の試薬を使えば、比較的均一に全ゲノムを増幅できますよ。しかも理論的には、ランダムプライマーを用いて、元が2本鎖であっても1本鎖のDNAが増えてきます。REPLI-gなどの製品がありますね。

(無題) 削除/引用 No.3903-12 - 2015/02/28 (土) 00:14:53 - 通りすがりA 質問者と回答者の間に齟齬があるように感じます。 基本的に、大量の一本鎖DNAを調整するだけなら他の回答者の返答で問題ないのでは。 勝手な予想で申し訳ございませんが ゲノムDNAの複数箇所にアニーリングするような、例えばランダムオリゴプライマー、もしくはトランスポゾンなどの反復配列を元に設計したプライマーでプライマー伸長を行い、その一本鎖DNAを調整したいのでしょうか。 その場合、得られる一本鎖DNAの量を全て揃えたい場合がでてくるかもしれません。そのような意図の質問なのでしょうか。 その場合は、高濃度のKlenow fragmentを利用するとほぼ均一にすべての断片を増幅できるようです。（低温で伸長反応を行えるかららしいですが、詳しいことは分かりません。） 的外れな場合は申し訳ございません。

(無題) 削除/引用 No.3903-11 - 2015/02/27 (金) 16:47:40 - seven どういう目的で実験を考案されているのかわかりませんが、合成効率を100%近くまであげたことを評価できる指標はあるのでしょうか？どんな方法をつかうにしても客観的に評価できる指標がないと机上の空論といわれてもしかたがないと思うのですが

(無題) 削除/引用 No.3903-10 - 2015/02/27 (金) 16:16:51 - mana みなさん　ありがとうございます。 プライミングの効率を上げるというのがやっぱりいいんですね。 具体的には、プライマー濃度を上げる、プライミング温度までゆっくり温度を下げていく、の他にどのような方法があるでしょうか？ single stranded binding proteinなどを使う方法も良さそうですがプライミング効率を論じている論文が見つからないので効果がわかりません。

(無題) 削除/引用 No.3903-9 - 2015/02/27 (金) 15:32:10 - おお プライまーをビーズに固定しextension後、上澄みを新たなプライまービーズでアニーリングっていうのは理想的にはできそうだけどロスなど考えるとprimingの効率をあげた方がいいとおもえる。

(無題) 削除/引用 No.3903-8 - 2015/02/27 (金) 14:39:36 - おお qPCRでは100%と言っていいくらいのprimingができていると思うのですが、どの程度までが誤差と考えられているのか、、、 鋳型をいじれるなら、primerがつくところをRNAにしてキメラの核酸にしてextensionのあとRNaseH切断というのができますが、、、 あとはPsoralensとかreactiveなものをプライまーにくっつけといて離れなくするとか。。。 いずれにしろなんか仕組みをつくったら、その効率もoutputに影響するだろうから、、、、

(無題) 削除/引用 No.3903-7 - 2015/02/27 (金) 14:35:33 - aa いまいち目的が見えてこないので的外れかもしれませんが。 アニーリングの効率が100%ではないとして、サイクルを増やしたところで100%に到達する事はないですよね。 極力ダブりがないように増やすということなら、シャトルPCRの酵素を使ってアニーリングと伸長を同時に行えば最大限の効率で1度に増幅できると思います。 長めに反応を行えば、それだけプライマーがつく確率があがるので、100%近くまで増幅効率を上げられると考えられます。 プライマーもdNTPも十分であるならば、生成した二本鎖DNAは次の伸長反応に寄与しないので除く必要はないのではないでしょうか。 今回の実験系で最も注意しないといけない点は、プライマーのミスアニーリングだと思われます。 PCRやシークエンス反応ではサイクル数を増やすことでミスアニーリングによるノイズを減らす事ができますが、今回の系ではミスアニーリングの影響が直接結果にでるはずです。

(無題) 削除/引用 No.3903-6 - 2015/02/27 (金) 14:09:39 - 中年 もちろん統計的なバラつきは生じますが。

(無題) 削除/引用 No.3903-5 - 2015/02/27 (金) 13:34:59 - 中年 100分子の鋳型の増幅効率に差がないのであれば、どの分子も平均すれば同程度複製されるでしょうから、産物の濃度を測定した後に100分子になるように希釈するというのでは駄目ですか？

(無題) 削除/引用 No.3903-4 - 2015/02/27 (金) 13:22:17 - mana みなさま さっそくお答えいただきありがとうございます。 質問の意味が誤解されているようなので、補足します。 たとえば１００分子のテンプレートDNAがあったとして、１cycleプライマー伸長反応を行った場合、プライミングの効率が100%でないので（実際に何％くらいかはわかりませんが）、１００％にするためにサイクル数を増やせばいいのかな？と思ったのです。 ただ、その場合、繰り返しテンプレートが使われる可能性が出てきてしまい、最終的に100以上の増幅産物ができてしまうと思います。 なので、一回使ったテンプレートを二度と使えなくできれば、何サイクルか回して、過不足なく元のDNAをコピーできるのかな、と思っているのですが、そのような手段が見つからないんです。

(無題) 削除/引用 No.3903-3 - 2015/02/27 (金) 13:00:27 - おお じっさいのpcrのprimerはテンプレートからみて大過剰はいってますので片側のプライまーだけでサイクルをまわすと、もとのテンプレートを鋳型にprimerから何回でも伸長ができます。まあ何回でもといっても常識の範囲内ですけど。

(無題) 削除/引用 No.3903-2 - 2015/02/27 (金) 12:29:30 - aa テンプレートを繰り返し利用する事に何か問題があるのでしょうか？ 1回しか使いたくないのにサイクルにする意味がよく理解できないのですが。 普通プライマーは過剰量入れるので、1回の反応で足りない事はないと思いますけど。 それでもアニーリングできなかったテンプレートがあるかもしれないから、アニーリングしたものを除いてもう1回、という意味ですかね。

一本鎖DNAの生成 削除/引用 No.3903-1 - 2015/02/27 (金) 11:41:00 - mana 抽出したDNAから、センスプライマー（あるいはアンチセンスプライマー）のみを使って一本鎖DNAを得ようと思っています。 その際に、できるだけすべてのテンプレートDNAから一本鎖を得たいと思っています。現在行っているのは、PCRと同様の反応液をプライマーを片側だけにして合成し、最初のdenaturingのあとにゆっくりとアニーリングの温度まで冷やして、その後Extentionするという方法を取っています。 この方法だと、プライミングが一回になってしまうため、合成効率が悪いと考えています。なので、PCRのようにサイクルを回せばいいとも追うのですが、そうすると一回使ったテンプレートをもう一回使ってしまいます。なので、プライマーがくっついて一回テンプレートして利用されたDNAが、二度とテンプテートとして利用できないようにすればよいのかな？と思いました。 そのようなことが可能かわかりませんが、なにかご存知でしたら教えてもらえないでしょうか？ よろしくおねがいします！

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