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(無題) 削除/引用 No.3920-25 - 2015/03/11 (水) 18:53:34 - 中年 pSC101のような低コピーのプラスミドにまずはクローニングしてみては？

(無題) 削除/引用 No.3920-24 - 2015/03/11 (水) 18:23:00 - AP >ちなみに、ゲノムのコンタミだとすると、PCR産物を精製した場合にどのくらい可能性があるのか疑問です。シークエンスを確認してひっかからないということですし、たまたま近い大きさのゲノム断片が同じ制限酵素サイトを持っている、ということですかね。 プラスミドは大腸菌から精製されるものなので不思議でもなんでもないです。大腸菌ゲノムがベクタープラスミドにコンタミしていればXmaI/NheI消化断片は少なからず出来るはず。

(無題) 削除/引用 No.3920-23 - 2015/03/11 (水) 16:36:21 - おお >[Re:22] ppさんは書きました : > ちなみに、ゲノムのコンタミだとすると、PCR産物を精製した場合にどのくらい可能性があるのか疑問です。シークエンスを確認してひっかからないということですし、たまたま近い大きさのゲノム断片が同じ制限酵素サイトを持っている、ということですかね。 インサート側からの持込ではなく、たぶんプラスミド側からの持込でしょう。プラスミドを切ってから電気えいどうで精製したらな可能性が低いですがどうされたのかもかいてない。 制限酵素サイトに丁寧に削れたりせずに入っているところがどうもなにからライゲーションで違うものが入った事を示唆しているようにおもいます。

(無題) 削除/引用 No.3920-22 - 2015/03/11 (水) 16:28:37 - pp 原因がコンタミなのか制限酵素の消化不良なのか大腸菌の組換えなのか不明のままですが、最初の方でmonさんが提案している全長のクローニングをしたほうが早い気がします。 TOPOでもTAベクターでも一度クローニングベクターに入れてから制限酵素で切断した方が切断効率よいでしょうし。 大腸菌内の組換えが問題ならダメでしょうけど。 ちなみに、ゲノムのコンタミだとすると、PCR産物を精製した場合にどのくらい可能性があるのか疑問です。シークエンスを確認してひっかからないということですし、たまたま近い大きさのゲノム断片が同じ制限酵素サイトを持っている、ということですかね。

(無題) 削除/引用 No.3920-21 - 2015/03/11 (水) 15:26:40 - 小言幸兵衛 最後は線虫に導入するのだから、十分な量のプラスミドを酵母から調整するのは現実的ではないでしょう。 最後の「プラスミド抽出」というのが大腸菌へ形質転換する操作を含むとしたら、それができないことがここで問題になっているのです。

(無題) 削除/引用 No.3920-20 - 2015/03/11 (水) 15:18:37 - いぬ >で、そこからどうするの？ PCRで断片付きで増やす →エレガンス用のori、PCR断片、酵母用ベクターを同時にTF →酵母培養、プラスミド抽出 じゃだめかな？かなり面倒だけど、どうしても大腸菌で増えないなら。

(無題) 削除/引用 No.3920-19 - 2015/03/10 (火) 22:57:42 - 小言幸兵衛 で、そこからどうするの？ > 酵母が使えるならギャップリペアクローニングすればそれで終わりじゃないですか？

(無題) 削除/引用 No.3920-18 - 2015/03/10 (火) 17:54:13 - いぬ 酵母が使えるならギャップリペアクローニングすればそれで終わりじゃないですか？

(無題) 削除/引用 No.3920-17 - 2015/03/10 (火) 15:30:44 - おお >[Re:14] pandamanさんは書きました : > > 知識不足で失礼致しますが、ATP-dependent DNaseは何の目的で利用するのでしょうか？ http://arb-ls.com/products/plasmidsafe_atp_dependent_dnase/ > > 今のところ、部分的にdeletionした場合はなく、丸ごと入れ替わっていることだけです。 それならなおさらインサートをいれたいプラスミドを精製した際に大腸菌ゲノムなどが混じっていたり、 PCRプロダクトに混じっていた可能性を疑います、なぜ制限酵素の部分でちゃんと利コンビメーションが起こるのか考えるとあまりいいロジックが見当たりません。

(無題) 削除/引用 No.3920-16 - 2015/03/09 (月) 22:02:01 - AP >部分的にdeletionした場合はなく、丸ごと入れ替わっていることだけです。 大腸菌の中でゲノムと組換えたのだとしたら、そういうことが起こるとは考えにくいです。やはりコンタミした大腸菌ゲノムがライゲーションで組み込まれたんでしょう。

(無題) 削除/引用 No.3920-15 - 2015/03/09 (月) 20:15:52 - AP >pPD95.77というベクターに由来しており、 おもいっきりlacPが生きてるみたいですが。 https://www.addgene.org/1495/ それとも別途、削ってあるのかしらん？ >pBR322_originが含まれています。 ややこしいのですが、ひょっとするとpUC oriを意味している可能性もあるので注意です。実はpBR322もpUCも同じpMB1 oriなんですが、pUCのそれは温度感受性突然変異でコピー数が高くなっています（低温だと野生型、低コピー数）。つまりpUCのoriのプロトタイプはpBR oriなので、pUCのoriであってもpBR322 oriと記載されている場合があって、Addgeneでもそういう例にあたったことがあったような。

(無題) 削除/引用 No.3920-14 - 2015/03/09 (月) 18:30:39 - pandaman 皆さまご助言ありがとうございます。 使っているベクターの基本骨子はpPD95.77というベクターに由来しており、pBR322_originが含まれています。因みにStbl2でクローニングしたときには30℃でインキュベートしているので低発現量の条件も試しているという事になりそうです。 BLASTのdotprotなどを用いて反復配列があるか調べましたが、今のところ反復配列は検出されません。 momさんの紹介して頂いたサイト http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html では私のクローニングしようとしてるcDNAのコード領域内にプロモーター配列が予測されましたので、ご指摘の通り、何かのタンパク質が発現してるのかもしれません。 PCRのテンプレのcDNA libraryは線虫のlysateから作ったものですが、線虫の餌として大腸菌を使っているのでコンタミの可能性はあります。 知識不足で失礼致しますが、ATP-dependent DNaseは何の目的で利用するのでしょうか？ 今のところ、部分的にdeletionした場合はなく、丸ごと入れ替わっていることだけです。 とりあえずベクター骨子を変えてみる、DH5a, stbl2以外の大腸菌を試してみる、の2つをやってみようかと思いますが、それでもだめならばcDNA内の予測されるプロモーター配列のコドンusageを変えてみます。

(無題) 削除/引用 No.3920-13 - 2015/03/08 (日) 01:16:55 - 中年 PCRの鋳型はプラスミドなのですか？ もしそうならベクタープラスミドは何ですか？

(無題) 削除/引用 No.3920-12 - 2015/03/07 (土) 16:43:11 - AP 線虫分野のリソースのことはよく知りませんが、 例えばこのベクターのように、pUC骨格のMSCにプロモータなどを組込んで構築されているために、MCSに向かうlacPがそのまま生きているということはありえます。 http://www.wormbook.org/wli/wbg12.2p17/

(無題) 削除/引用 No.3920-11 - 2015/03/07 (土) 15:25:24 - おお ちょと皆さんのコメントを読んでない部分がありますので、重複するところはありますが、大腸菌の配列が混じるという理由に精製したプラスミドに認識できてないけどいくらか大腸菌のゲノムのフラグメントが混入している可能性があります。対策としてはプラスミドを制限酵素処理後に電気泳動で精製。また ATP dependent DNase などを利用などです。 もし大腸菌が嫌っているときは、insertの一部がdeletionしたようなクローンなども取れてきそうです。大腸菌ゲノムの混入で目的のインサートより短い大腸菌のフラグメントがライゲーションで優先的に入るため物が取れなくなっているような印象が強いです。

(無題) 削除/引用 No.3920-10 - 2015/03/06 (金) 10:07:42 - AP ベクターの骨格（プラスミドのoriタイプ）は基本情報としてあるはずですよね。 pUCということでしょうか。 repeatの検出はharplotという手法が便利です。 以前の投稿のリンク先がまだ生きています。 http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2/biotechforum.cgi?mode=view;Code=2758 SeaViewというソフトのEdit->Dotという機能で可能です。

(無題) 削除/引用 No.3920-9 - 2015/03/06 (金) 08:16:01 - mon RepeatMaskerはAlu repeat等のゲノム上に存在する反復配列を見つけるアプリではなかったかな？ DotMatrix解析すると内在の反復配列の位置が線状に表示されます（ただしパラメータの設定が必要）。 プロモーター様配列は、例えば http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html などで検索できます。 なお、「その上流にあるのは線虫の表皮などに発現活性のあるプロモーターであり、大腸菌で活性があるものではないはずです。」：これは当てはまりません。たまたま「大腸菌で活性がある」配列が含まれていることがあります。例えば、ほ乳類のCDS内に大腸菌プロモーター様活性があることもありますし、大腸菌Amp遺伝子内にほ乳類細胞で働く弱いプロモーター活性があります（luciferaseアッセイベクターの漏洩発現の原因となります。"cryptic promoter"と呼ばれます）。

(無題) 削除/引用 No.3920-8 - 2015/03/06 (金) 00:07:13 - pandaman >AP さん ご助言感謝致します。 用いているのは線虫に形質転換した際に発現活性のあるベクターです。 今回、XmaI/NheIサイトにcDNAをクローニングしましたが、その上流にあるのは線虫の表皮などに発現活性のあるプロモーターであり、大腸菌で活性があるものではないはずです。古くから線虫の実験に用いられているベクターをbackboneとしているのですが、大腸菌内での複製機構の詳細はもう少し調べる必要があり、APさんのご助言のようにlacオペロンを抑制する必要があるかどうか検討してみます。 培養細胞系で用いられているベクターに関してはあまり詳しくないので、pUC vectorに関してなど、もう少し調べる必要がありますが、とりあえず現状をご報告です。

(無題) 削除/引用 No.3920-7 - 2015/03/05 (木) 23:43:46 - pandaman >mom さん ご意見ありがとうございます。 コドンusageを変えるのは確かに良い方法かもしれません。 反復配列や大腸菌で活性のあるプロモーターは確かに有害かもしれません。 ただ、RepeatMaskerというWEB上のアルゴリズムを利用してみたのですが、反復配列は検出されないようです。 もし反復配列の検出用の良いソフトをご存じでしたら教えて頂きたいです。 目的のcDNAは約3 kbpなので、さすがに目視では反復配列の検出は難しいです。

(無題) 削除/引用 No.3920-6 - 2015/03/05 (木) 21:05:35 - mon 日本語が変でしたので修正... (3)市販されているコピー数が制限される（減少する）大腸菌コンピテントセルを試す。

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