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Hisタグ付タンパク質の精製 トピック削除
No.3964-TOPIC - 2015/03/26 (木) 11:27:51 - HHHHHH
酵母分泌系を用いてHis-tagまたはHA-tag付タンパク質を作製しております。
培養液から目的タンパク質を80%硫安で沈殿させたのち、リン酸バッファーで溶解させ、アフィニティー精製する手順です。
抗体を用いたアフィニティ精製の時では硫酸アンモニウム除去のために透析や脱塩を行う必要があると思うのですが、Niカラムを用いたHis-tag精製における透析、脱塩の必要ってあるのでしょうか？
硫安沈殿物をリン酸バッファーで溶解後、そのままNiカラムで精製出来れば、透析・脱塩による収率の低下、時間を軽減出来ると思うのですが、いかがでしょうか？
　
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(無題) 削除/引用
No.3964-7 - 2015/03/31 (火) 08:47:20 - qw
＞培養液から目的タンパク質を80%硫安で沈殿させたのち
培養上清は、希薄なタンパク質溶液でしょうから、硫安沈殿する事自体それなりに大変かもしれません。効率よく硫安沈殿できていることを確認できるのであれば良いと思います。

(無題) 削除/引用
No.3964-6 - 2015/03/28 (土) 01:44:58 - おお
アンモニウムをつかわないといういみで


硫酸イオンが塩せきに有効なのですが、アンモニウム塩が溶解度が高いので、硫安が使われるようです。ナトリウムやカリウムでは硫安ほど高い濃度でとけないですが、それでも沈殿するならそれを使ってみる手はあるかもしれません。濃度的にはちょっと厳しいかなあと思いますけど。MgSO4だとちょっとましですが、Mg++イオンはカオトロピックな作用がありますから、、、

あと塩せきを促せそうなのはNaClとかですね。

http://ja.wikipedia.org/wiki/%E3%83%9B%E3%83%95%E3%83%9E%E3%82%A4%E3%82%B9%E3%82%BF%E3%83%BC%E3%82%B7%E3%83%AA%E3%83%BC%E3%82%BA

申し訳ないです 削除/引用
No.3964-5 - 2015/03/27 (金) 10:23:28 - NM
>[Re:4] おおさんは書きました :
> QiagenのNi-NTA Spin Kit Handbookでは
> Ammonium Not recommended
> となってますね。。。
> https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=3fc8c76d-6d21-4887-9bf8-f35f78fcc2f2&lang=en


気になって手元にある資料を調べたのですが、アンモニウムイオンはダメなようです。
すみません。前言撤回です。
昔のアマシャムのHisTrapの説明書では塩化アンモニウムで溶出することができると書いてあるものもありました。


質問者様へ
硫安沈殿の代わりにPEG沈殿はいかがでしょうか？

(無題) 削除/引用
No.3964-4 - 2015/03/26 (木) 22:49:31 - おお
QiagenのNi-NTA Spin Kit Handbookでは
Ammonium Not recommended
となってますね。。。
https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=3fc8c76d-6d21-4887-9bf8-f35f78fcc2f2&lang=en

(無題) 削除/引用
No.3964-3 - 2015/03/26 (木) 20:42:00 - NM
Ni affinityではありませんが、Strep-tagで同じような実験をしたことがあります。再溶解に使うBuffer量によると思いますが、Ni-affinity精製可能だと思います。何をもってBuffer量を多い・少ないとするかは難しいのですが、十分希釈してください。

それと、使用するNiカラムに硫安濃度の上限が書いてあったように思います。ぜひ、確認してください。

(無題) 削除/引用
No.3964-2 - 2015/03/26 (木) 16:07:32 - おお
アンモニウムイオンが邪魔になりそうだけど。。。

Hisタグ付タンパク質の精製 削除/引用
No.3964-1 - 2015/03/26 (木) 11:27:51 - HHHHHH
酵母分泌系を用いてHis-tagまたはHA-tag付タンパク質を作製しております。
培養液から目的タンパク質を80%硫安で沈殿させたのち、リン酸バッファーで溶解させ、アフィニティー精製する手順です。
抗体を用いたアフィニティ精製の時では硫酸アンモニウム除去のために透析や脱塩を行う必要があると思うのですが、Niカラムを用いたHis-tag精製における透析、脱塩の必要ってあるのでしょうか？
硫安沈殿物をリン酸バッファーで溶解後、そのままNiカラムで精製出来れば、透析・脱塩による収率の低下、時間を軽減出来ると思うのですが、いかがでしょうか？
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