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(無題) 削除/引用 No.3983-7 - 2015/04/05 (日) 06:11:43 - おお http://www.pnas.org/content/96/1/266.full.pdf この論文ではバックグランドは1000CPMあたりですね。細かいことはおいておいてバックグランドを下げることを考えればいいでしょう。たとえば実験で生じるエラーがプラスマイナス15%として w/o protein 6000±900CPM(5100-6900) w/ protein 8000±1200CPM(6800-9200) これならw/ proteinのあたいがバックグランドとかぶってしまい、バックグランド以上のシグナルがあるといいにくくなってくる(n=3ぐらいの統計ではバックグランドと比べて統計的有意差もいうのが難しい)。 w/o protein　2000±300(1700-2300)CPM w/ protein 4000±600(3400-4600)CPM こっちならベターですよね。 APさんが指摘してますが、S/N (signal/noise)が測定の時に考慮すべき要因で、ノイズ(バックグランド)下げたほうがよりよい値が得られるといえます。 まああまりボスといいあっても生産性がないかもしれませんので、ある程度納得がいきそうな条件で3回ほどやって再現性がとれているというのを見せたうえで、ほかのデーターとの条件などの違いによる差別化も説明して、納得してもらえるようにするのがいいのかなぁと漠然とおもいます。 ポジこんになるものがありますか?

(無題) 削除/引用 No.3983-6 - 2015/04/04 (土) 15:02:52 - おお >[Re:5] APさんは書きました : > >lipid ligandの場合、比較的Backgroundは高くなり非常に難しいとは聞いています。 > > 経験者の話を聞くのも有用だけれど、それに重きをおくこと、先入観にとらわれて、先に決めつけてしまうのは感心しない。 > > わたしもAPさんと同様の懸念があるのですが、プロとコールについて詳しくかかれたpublicationはないでしょうか? Methods in EnzymologyとかNature protocolsとか。バックグランドが高くなるのはそうなんでしょうけど、もっと具体的にどれくらいなら測れているだろうという基準を考えるべきだと思います。 あとタンパク量を半分にして、そのかわりコレステロールがつかない蛋白をうめて、蛋白量を一定にしたような状態でえられるスペシフィックなシグナルは半分になりますか? 系が働いているかどうかはそういういろいろな角度での検証をして判断することも多いと思います。

(無題) 削除/引用 No.3983-5 - 2015/04/04 (土) 14:46:49 - AP >lipid ligandの場合、比較的Backgroundは高くなり非常に難しいとは聞いています。 経験者の話を聞くのも有用だけれど、それに重きをおくこと、先入観にとらわれて、先に決めつけてしまうのは感心しない。

(無題) 削除/引用 No.3983-4 - 2015/04/04 (土) 14:44:59 - AP >彼曰く、Total bindingの数値を維持して、Backgroundの数値を下げれて その割合を高く城ということでした。 言わんとしているのは、S/Nを上げろというあたり前のことでしょう。 そりゃ、現状のS/NではTotalの数値が同じならbackgroundの値は変えようがないですが、S/Nが改善出来ればTotalの値が同じ水準でもデータの質が向上します。 >しかしPIの方は一回目のデータは(8000-6000)/8000=25%で 2回目のデータは(4000-2000)/4000=50%で2倍ものバリエーションがあるので 実験は失敗だという解釈です。 この論議はおかしいです。取っている値の大きさによりS/Nは変化します。値が小さい時のS/Nと大きい時のS/Nを比べてみて、小さい時のほうがノイズ比が高くなるのは普通でしょう。 Dolby のノイズリダクションシステムの根本原理もそういうことなんですが、わかりますかねえ。カセットテープ世代の人にはおなじみなので、ボスがそうであればDolbyを例にとると説得しやすいかも。

(無題) 削除/引用 No.3983-3 - 2015/04/04 (土) 14:24:56 - NUPD おお様 丁寧なご回答ありがとうございました。 Lipid ligandの場合、比較的Backgroundは高くなり非常に難しいとは聞いています。 最低でもTotalの50％以下に持って生きたいとは考えております。 昨日いくつかの条件でやった中で条件Ａでtotalの30％、条件Ｂで50%となり、 それを組み合わせた結果20％となり、それについてディスカッションしている中で 先述のような状況になったわけです。 Ligand assayをメインにやられてる方に聞いたところ、 それが、その条件におけるそのLigandの特徴(backgroundが高い)として Specific bindingの数値に集中して進めたほうがいいという方もおり、 少々こんがらがってしまってました。 確かに条件を変えた場合フィルターにおけるノンスペを減らすだけでなく、 Binding効率の最適化も含めて検討しなおしてみます。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3983-2 - 2015/04/04 (土) 11:57:02 - おお たしかにあなたのPIのおっしゃることはよくわからないところもあるのですが、バックグランドが高すぎるという印象があります。それが許容されるかどうかは実験やばらつきににもよるかもしれませんが、そういう事情を知らない人が見ると、そのデーターでついているというのは厳しいんではないかと思うでしょう。 あと条件が違うデーターでバックグランドとの差が両方とも2000CPMだからといって、再現性あるというのも変です。条件が違うのですから、同じにならない可能性がまあまああると思いますから。 そのタンパク質がどれだけのキャパがあって、理論的にえられるCPMは計算できますよね。それとどれくらいかけ離れてますか? コレステロール様でその蛋白につかない化合物があれば、コールドのその化合物をコレステロールに対して10倍以上の過剰な量入れることでバックグランドが押さえられるかもしれません。

Ligand binding assayの解析 削除/引用 No.3983-1 - 2015/04/04 (土) 11:20:40 - NUPD 質問させてください。 現在Ligand binding assayをやっているのですが解析の仕方についてです。 Ligandはコレステロールの一種でバックグラウンドが高くなるのはよくあることなのですが、 たとえば実際の測定値が w/o protein 6000CPM w/ protein 8000CPM であったとします。 その場合のspecific bindingは2000CPMとなると思います。 バックが高いため条件を変えて測定をしたのですがその際 w/o protein　2000CPM w/ protein 4000CPM となりspecific bindingは同様に2000CPMとなりました。 しかしPIの方は一回目のデータは(8000-6000)/8000=25%で 2回目のデータは(4000-2000)/4000=50%で2倍ものバリエーションがあるので 実験は失敗だという解釈です。 実際の測定値よりもSpecific bindingのTotal readingに対する割合が重要で Specific bindingなどの実測地は何の意味も無い、失敗だということでした。 Specific bindingはTotal readingからBackgroundを引いた値であり その値が一致していることが重要だと解釈しています。 もちろんBackgroundを減らせば相対的にその割合は増えるのはわかりますが、 納得がいきません。 彼曰く、Total bindingの数値を維持して、Backgroundの数値を下げれて その割合を高く城ということでした。 Total binding=background+specific bindingだと解釈しているので backgroundを下げればTotal readingも同様に下がるはずなのですが。。。 ちょっと混乱してきていまして、詳しい方の解析方法などご意見をお聞きしたいとおもい 投稿させていただきました。 それではよろしくお願いします。

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