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お返事ありがとうございます。 削除/引用 No.4543-3 - 2015/11/03 (火) 23:24:45 - ねむねむ たていすさん お返事ありがとうございます。 具体的にはHRH1をやっています。 RRAは、リガンド・受容体によって最適なバッファー条件などなど細かく変わるので、何が最適かはやってみたいとわからないってところだと思っています。 おっしゃるようにGF/Bで分離するのは膜標品での実験が一般的で、可溶化したものは無理じゃないかという印象があります。 しかし、 Kidrič, Marjetka, et al. "Solubilization of dopamine‐D2receptors from synaptosomal membranes of the bovine caudate nucleus." British journal of pharmacology 83.3 (1984): 687-695. などを始め、幾つかの受容体でこの方法を用いた結合実験をされていたので、期待してやってみているところです。 ニトロセルロースは一度試してみてもいいかもしれないですね。 リガンドの非特異的な結合がないかどうかちょっと調べてみます。

(無題) 削除/引用 No.4543-2 - 2015/10/30 (金) 20:56:21 - たていす GPCRとの事なので、Lefkovitzの論文を見てみると、可溶化したA1-adrenergic receptorの時はSephadexG50でゲルろ過してB/F分離しているな。 グラスフィルターGF/Bで分離するのは、膜標品のbinding-assayでないと無理筋かと思います。（やっていることもあるかもしれませんが） G-proteinのbinding assayの時のように、ニトロセルロースフィルタにタンパクを吸着させてassayできると簡単だろうね。 リガンドや可溶化したタンパクの性質によって、binding assayは異なる方法を使うだろうから、どれが良いかは解りません。

GF/Bを用いた可溶化受容体のRRA 削除/引用 No.4543-1 - 2015/10/30 (金) 18:14:12 - ねむねむ はじめまして。 あるGPCRのRIリガンドとの結合実験をしています。 可溶化した状態での結合能の評価のために、古くからある方法を試していますがうまくいきません。 具体的には、リガンドと受容体を反応させた後に、ガンマグロブリンを加え、さらにポリエチレングリコール６０００を加えれvortex後に氷上に１５分静置。 その反応液をPEIで処理したGF/Bで吸引ろ過する方法です。 ろ過したフィルターを液シンで測定した時にかなりばらつきが出てしまいます。 氷上静置でポリエチレングリコールのなかに絡めるとっているようなイメージを持っているのですが、これをフィルタに通す前のピペッティングの具合によってGF/Bをすり抜けなかったり、すり抜けたりというばらつきが出ないかが気になります。 実際にやられたことがある方がいらっしゃいましたらtipsを教えていただけると嬉しいです。よろしくお願いいたします。

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