BioTechnicalフォーラム [アガロースゲル抽出の収率が悪すぎる]

アガロースゲル抽出の収率が悪すぎる

No.4707-TOPIC - 2015/12/30 (水) 02:39:17 - noa

はじめまして。
現在ベクタープラスミドを構築するために制限酵素を行いアガロースゲル電気泳動からゲル抽出による精製を行おうとしている者ですが、どうしても収率が上がりません(元の1/100程度の濃度になる)
マッハライ・ナーゲル社の『NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up』を使っており、収率が低いDNAは3700bp程度の物です。
アガロースゲルは1%の物を利用しているのでプロトコル通り200μl/100mgのNTIバッファーでゲルを溶かしています。また収率が低く少し長めのDNAである事も考えて70度にインキュベートしたNEバッファー30ml×3回で抽出しています。
皆様の中で私のように収率が上がらないで悩んでいる方やそれの解決法を知ってい方などおられましたら是非教えてください。

ついでにもう１つなんですが、2%のゲルを使っている時のNTIバッファの量ってどうされてますか？
こちらも情報が欲しいです。
よろしくお願いします。
　

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たくさんのコメントをありがとうございます。

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No.4707-12 - 2016/01/07 (木) 00:48:13 - noa

たくさんの助言をありがとうございました。
>これってカラムからの溶出のときのことでしょうか。７０度で溶出したら改善したと言うのは聞いたことがないのですが、情報のソースとかないでしょうか。
>70度の水を通すっていうsuggestionがマニュアルにあるのですね。
70℃のNEバッファーで溶出するやり方はキット付属のプロトコールに記載されていたものです。(http://catalog.takara-bio.co.jp/com/tech_info_detail.php?mode=2&masterid=M100005218&unitid=U100006678)(リンクはタカラバイオの製品ページです。)
返信が大変遅くなってしまい申し訳ありません。

>アガロースゲル電気泳動のバッファーがTAEでなくTBEだと別の処理(pHを下げる溶液の添加や溶解液の増量）が必要かも。
質問の記述に必要な情報が少なく大変申し訳ありません。泳動バッファーはTAEを使用しています。

>PCR Clean-upは問題なく行えますか？
>ゲルを溶かすステップを丁寧にやってみてはどうでしょうか。
はい、PCR Clean-upは正常に行えています。つまりカラムには問題がないように思われます。NT1バッファーの量を増やしてゲルの溶解をもう少し丁寧に行ってみます。

皆さまからいただいた助言を参考に「メンブレンに詰まっているのでは？」と思いカラムに400μLのTEバッファーを加えしばらくピペッティングし、回収したTEバッファーに対しPCI・CIA抽出、エタノール沈殿の処理を行った結果、400ng程度のホスト、インサートを得られました。
この製品でゲル抽出を行うにはゲルの溶解をプロトコール以上に慎重に行うと上手くいく可能性があるように感じました。

(無題)

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No.4707-11 - 2016/01/05 (火) 09:29:59 - ふみ

ゲルを溶かすステップを丁寧にやってみてはどうでしょうか。
もう少し具体的には、[混ぜる・インキュベート数分]をあと1セットもしくは2セット追加。

(無題)

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No.4707-10 - 2016/01/05 (火) 02:05:11 - おお

70度の水を通すっていうsuggestionがマニュアルにあるのですね。失礼しました。

(無題)

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No.4707-9 - 2016/01/04 (月) 17:41:37 - はっち

私の研究室でも同じ製品を使っています。
70℃というのは下の補足欄の記述に従ってということですよね？
私ではなく他の教室員の経験談ですが、温めると逆に収量が落ちると言っていました。
なので私の研究室では温めずに使用しています。
収量アップのコツとしては、100μlで抽出する場合、30・30・40と分けて繰り返し抽出すると
収量が上がったという経験はあります。
面倒だし一気にやっても収量に問題ないので一気にやってますが。

(無題)

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No.4707-8 - 2016/01/04 (月) 12:09:09 - bluehornet

noaさんの使っているカラムでPCR Clean-upは問題なく行えますか？
もし、PCR Clean-upもうまくいかないならカラムの劣化が考えられます。
PCR Clean-upに問題が無ければ、ゲルに対するNT1の量を増やす（2倍とか3倍）と改善するかもしれませんよ。

(無題)

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No.4707-7 - 2015/12/30 (水) 11:55:27 - おお

1ugぐらいあって、ライゲーションに使うならゲル切り出し、なるべく細かく砕いてフェノール抽出（フェノール単独の抽出を数回行ってアガロースがなくなってから）、クロロフォルム抽出エタ沈でヘタしても１００ngは取れるから４ー５回のライゲーションのためのDNAはとれる。
たしかに３ー４kbpではあまり長いとう気はしません。mammalian expression vectorとかのたぐいはマーカがついてたりすると５、６kbpは少なくともありますし。そういうのを扱うことはたたあるとおもうので、キットはそのへんで使えなければ役に立たない。

(無題)

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No.4707-6 - 2015/12/30 (水) 11:42:17 - mon

ちなみに~200ugくらいのDNAを精製するには、LMPアガロース＋Thermo-Stable beta-agarase処理＞（PCI抽出＞）（共沈剤を加えて）EtOH沈が経済的です。

(無題)

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No.4707-5 - 2015/12/30 (水) 11:37:58 - mon

NucleoSpinではなく別会社の製品を使っていますが、アガロースゲル電気泳動のバッファーがTAEでなくTBEだと別の処理(pHを下げる溶液の添加や溶解液の増量）が必要かも。
収率が悪い場合、遠心が不十分で溶解液・洗浄液が残留している可能性もあるので、遠心時間を長くする・カラムの洗浄回数を１回追加すると収率が上がることがあります。
なお、3.7kbくらいなら「長いDNA」には当たらないと思います。
かなり前に使っていたさらに別の製品ではカラムのロットによって収率が悪いものが有り、交換してもらいました。メーカーに問いあわせてみては？

(無題)

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No.4707-4 - 2015/12/30 (水) 09:09:47 - ano

以前に同様の商品を使ったことがあって、同じ悩みをもっていました。
カラム抽出はあきらめて、Exosapに移行しました。

(無題)

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No.4707-3 - 2015/12/30 (水) 04:34:24 - a

以前に同じキットを使用していましたが、特に困ったことは無かったように思います。
そこまで収率が低い原因は分かりませんが。。。
どのくらいの量のベクターを切断、泳動して、バンドを見た感じそれだけの量が有りそうですか？
洗浄バッファーに加えたエタノールの量は適正ですか？長いこと蓋が開いていてエタノールの割合が変わったりはしていませんか？

NTIバッファーの量について
2%でも同じで問題ないです。
アガロースからの回収について
必要ですか？ゲルからの回収が難しければ、制限酵素切断後の確認として少量流して、（ゲルで見る限り100%切れていれば）反応液を精製して使用しても良いかと思います。

(無題)

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No.4707-2 - 2015/12/30 (水) 04:27:14 - おお

>また収率が低く少し長めのDNAである事も考えて70度にインキュベートしたNEバッファー30ml×3回で抽出しています。

これってカラムからの溶出のときのことでしょうか。７０度で溶出したら改善したと言うのは聞いたことがないのですが、情報のソースとかないでしょうか。
シリカカラムで全工程で冷やしたりしないほうがいいという話は聞いたことがありますけど（それも根拠に関してはよくわからないままですけど）。
あと泳動バッファーは何でしょうか？TBEならTAEに変えてみてもいいかもしれません。

＞ついでにもう１つなんですが、2%のゲルを使っている時

最初に使うゲルを溶かすバッファーのことですよね。多分pHの問題、十分カラムに吸着できる濃度のイオンがあるかと、ゲルが溶けるかというところがネックになっているのだと思います。前者２つはアガロースの濃度はあまり関係ないですよね、げるがとけるかは、様子を見ながら少しあとから加えるとかできますよね。

アガロースゲル抽出の収率が悪すぎる

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No.4707-1 - 2015/12/30 (水) 02:39:17 - noa

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