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EMSAでウェルに詰まる トピック削除
No.4712-TOPIC - 2016/01/03 (日) 18:05:04 - ななし
いつも参考にさせていただいています。

RNA結合タンパク質のEMSAを行っています。
RNAのみでは泳動されますが、タンパク質を入れるとシグナルがウェルに検出されるようになり、タンパク量を増やすと、フリーがなくなりウェルのシグナルのみとなります。

RNAは200nt程度でin vitro転写でRIラベルしたもの、タンパク質はRNA結合ドメイン部分のみの組換えタンパク質(分子量25kDa,pI9)を使用しています。
ゲルは、Thermofisherの6%DNA retardation gel、バッファーは0.5XTBEを使用しており、220Vで2時間半、アイスボックスで冷やしながら低温室で泳動しています。

pIが高いためにTBEバッファーでは逆方向に泳動されるのかと思い、pH9.5の炭酸バッファーで作製したゲルと泳動バッファーで泳動しましたが、泳動時に発熱してゲルが割れてしまいました。

pH9.5での電気泳動には無理があったのでしょうか？
泳動のpHを変える以外に詰まりをなくす方法はあるでしょうか？
どのように対処すればよいか分からず、アドバイスをいただければ幸いです。
どうぞよろしくお願いいたします。
　
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(無題) 削除/引用
No.4712-7 - 2016/01/04 (月) 07:18:32 - おお
ちなみにSDSPAGEでつかうゲルのバッファーは375mM TrisHCl(pH8.8)ですね。

(無題) 削除/引用
No.4712-6 - 2016/01/04 (月) 07:16:19 - おお
コンプレックスが大きいということであれば、アガロースでやるという選択しもあるかと思います。コンプレックスが大きくなくても移動度がPAGEで遅いときにもアガロースで見えがよくなるかもしれません。

(無題) 削除/引用
No.4712-5 - 2016/01/04 (月) 01:59:59 - 巨大コンプレックス
そのゲルをウエスタンしてみれば、そのタンパクの挙動がわかりますね。できれば、ｐHをいわれるように変えた２種のえいどう条件で。

それで、両方ともトップに来るのなら、巨大コンプレックスを作っていると言う結論になると思います。

(無題) 削除/引用
No.4712-4 - 2016/01/04 (月) 00:46:24 - おお
あ、ごめんなさいTris-glycineは標準のプロトコールはpH８.３でした。

(無題) 削除/引用
No.4712-3 - 2016/01/04 (月) 00:23:13 - おお
pHにかんしてはTris-Glycine pH８.８は使ってみてもいいかと。どうしてもpI以上にしたいならTris-GlycineのTrisの量比を上げて少しアルカリに振って見てもいいかもしれません。

ゲルで詰まるのを避ける一番安易な発想はデタージェントを加えることだと思います。NP-40/TritonX-100が一番ポピュラーです。濃度は大抵は０.１％位入れる人がおおいのではないかと。サンプルmixtureに入れて解決することもあるかと思いますし、ゲルにも入れたほうが良い場合もあります。

デタージェントをデオキシコール酸のような負電荷をもつものにすると蛋白に結合したときに負電荷をもたらすので、そういったデタージェントでもいいかもしれません。ただデタージェントは場合によっては蛋白を失活させる可能性があるところが悩ましいところです。デタージェントでなく思い切ってBlueNativePAGEと同じバッファーを使ってみてもいいかもしれません。CBBの負電荷を利用する方法です。その他にも蛋白の可溶化を促進する物がありますが、樹立されてない方法になる可能性があるので冒険になってしまうかもしれません。

(無題) 削除/引用
No.4712-2 - 2016/01/03 (日) 18:16:33 - AP
GSTかなにかの融合タンパク質にはできないのですか。
GSTだけというコントロールも取りやすいし。

EMSAでウェルに詰まる 削除/引用
No.4712-1 - 2016/01/03 (日) 18:05:04 - ななし
いつも参考にさせていただいています。

RNA結合タンパク質のEMSAを行っています。
RNAのみでは泳動されますが、タンパク質を入れるとシグナルがウェルに検出されるようになり、タンパク量を増やすと、フリーがなくなりウェルのシグナルのみとなります。

RNAは200nt程度でin vitro転写でRIラベルしたもの、タンパク質はRNA結合ドメイン部分のみの組換えタンパク質(分子量25kDa,pI9)を使用しています。
ゲルは、Thermofisherの6%DNA retardation gel、バッファーは0.5XTBEを使用しており、220Vで2時間半、アイスボックスで冷やしながら低温室で泳動しています。

pIが高いためにTBEバッファーでは逆方向に泳動されるのかと思い、pH9.5の炭酸バッファーで作製したゲルと泳動バッファーで泳動しましたが、泳動時に発熱してゲルが割れてしまいました。

pH9.5での電気泳動には無理があったのでしょうか？
泳動のpHを変える以外に詰まりをなくす方法はあるでしょうか？
どのように対処すればよいか分からず、アドバイスをいただければ幸いです。
どうぞよろしくお願いいたします。
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