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loxP-stop sequence-loxpカセット トピック削除
No.4998-TOPIC - 2016/04/18 (月) 06:04:38 - cre-loxP
組織特異的プロモーターでCreが発現するベクターと、CAG-loxP-Stop sequence-loxP-GFPベクターを共発現する細胞株を作ろうとしています。

loxP-Stop sequence-loxP-GFPをトランスフェクションして限界希釈法によりシングルセルを取り、増やす他のち、CMV-Creベクターをトランスフェクションし、loxP-Stop sequence-loxP-GFPが機能しているか確認したのですが、全くGFPが見られませんでした。

理論的にCAG-loxP-Stop sequence-loxP-GFPはたくさん発現しているはずなのにCreの発現でGFPが見られないのは、シングルセルがCAG-loxP-Stop sequence-loxP-GFPのカセットを持っていないからなのでしょうか？それとも、トランスフェクションで得られたステーブルだとコピー数が少ないため、レンチで発現量を高めないとCAG-loxP-Stop sequence-loxP-GFPが機能しているのが見られないのでしょうか？

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(無題) 削除/引用
No.4998-5 - 2016/04/18 (月) 08:21:59 - おお
>[Re:3] cre-loxPさんは書きました :
> おお様
>
> 理論的と言いますか、CAG promoterでloxP以降の配列が発現するのでたくさん発現しているはずと書きました
>
> CAG-loxP-Stop sequence-loxP-GFPとCMV-Creベクターの一過性コトランスフェクションではGFPの発現が見れているのでワークしていると考えています。


なら選んだ細胞に導入されてなかったあるいは、導入されたがワークしないようなインテグレーションが起こっているということかもしれません。後者は複数のクローンを拾っていればワークするクローンも見つかるはずです。前者なら発現するはずがないので、”たくさん発現しているはず”という発言がよくわかりません。

(無題) 削除/引用
No.4998-4 - 2016/04/18 (月) 07:54:05 - rec
限外希釈して、なぜ全てのクローンがCAG-loxP-Stop sequence-loxP-GFPを保持していると思うのか。
さらに、薬物耐性でセレクションしたとしても、CAG-loxP-Stop sequence-loxP-GFPが無傷のままゲノムに入っていることにはなりませんよ。
それともepisomal vector？

(無題) 削除/引用
No.4998-3 - 2016/04/18 (月) 06:54:05 - cre-loxP
おお様

理論的と言いますか、CAG promoterでloxP以降の配列が発現するのでたくさん発現しているはずと書きました

CAG-loxP-Stop sequence-loxP-GFPとCMV-Creベクターの一過性コトランスフェクションではGFPの発現が見れているのでワークしていると考えています。

(無題) 削除/引用
No.4998-2 - 2016/04/18 (月) 06:28:10 - おお
>理論的にCAG-loxP-Stop sequence-loxP-GFPはたくさん発現しているはずなのに

この理論なんに基づいているんでしょうか？
安定導入できているかどうか、そのトランスフェクションしたものが得られた細胞に存在しているかは、確かめようがありますし、方法論によるところもあると思います。

もう一つはお使いのCAG-loxP-Stop sequence-loxP-GFPはワークすることがすでに確かめられているコンストラクトですか？

loxP-stop sequence-loxpカセット 削除/引用
No.4998-1 - 2016/04/18 (月) 06:04:38 - cre-loxP
組織特異的プロモーターでCreが発現するベクターと、CAG-loxP-Stop sequence-loxP-GFPベクターを共発現する細胞株を作ろうとしています。

loxP-Stop sequence-loxP-GFPをトランスフェクションして限界希釈法によりシングルセルを取り、増やす他のち、CMV-Creベクターをトランスフェクションし、loxP-Stop sequence-loxP-GFPが機能しているか確認したのですが、全くGFPが見られませんでした。

理論的にCAG-loxP-Stop sequence-loxP-GFPはたくさん発現しているはずなのにCreの発現でGFPが見られないのは、シングルセルがCAG-loxP-Stop sequence-loxP-GFPのカセットを持っていないからなのでしょうか？それとも、トランスフェクションで得られたステーブルだとコピー数が少ないため、レンチで発現量を高めないとCAG-loxP-Stop sequence-loxP-GFPが機能しているのが見られないのでしょうか？

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