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(無題) 削除/引用 No.5009-5 - 2016/04/25 (月) 10:01:37 - si もう少し具体的に書いて貰わないとなんともいえませんが、うまくいかないというのはPCRが走らないということでしょうか？？ それともsequencemを読んでみて変異が思った通りに入らないということですか？ 順位？に入っていた遺伝子にAー＞G変異を入れるプライマーを逆位？の遺伝子にそのまま使うとセンス鎖？がCー＞Tに変わってしまう気がするんですが。 すいません。情報が少ないので勘違いかもしれませんが。

(無題) 削除/引用 No.5009-4 - 2016/04/25 (月) 09:54:54 - 独り言 うまくいかないというのがどのステップなのかわかりませんが、遺伝子が逆向きでも同じプライマーで全く問題ありません。 PCRが増えないのか？変異の入ったクローンが取れないのかわかりませんが、とりあえず、以前に使った同じプラスミドや同じ遺伝子が入った他のベクターをポジコンにして、行ってみるのがよいのではと思います。

(無題) 削除/引用 No.5009-3 - 2016/04/25 (月) 09:27:52 - おもいやり 変異導入の方法もいろいろあるし、うまくいかないというのがどのステップのことを言っているのかもわからないので、的確なコメントを求めるのは難しいと思います。 「ワークするはず」という根拠も自己満足なのかどうかも判断できないし。 昔うまくできたというプラスミドとプライマーを使ってもう1回変異導入実験をやってみて、変異が導入されるのであれば今回の実験設計がおかしいということになるし、変異が導入できないのであれば、実験試薬がおかしいということになります。 ひとまず、問題の原因が試薬かどうか確認してはどうですか。

(無題) 削除/引用 No.5009-2 - 2016/04/23 (土) 06:05:21 - おお その遺伝子と、ベクターの境界とか言うのでなければ、また、ベクター側のプライマーとかと組み合わせて使わない限りは、向きは直接関係ないと思います。昔変異をいれたものを切り出して、pcDNA3.1+に入れたりはできないんでしょうかねえ。。。

変異導入のことで確認させていただけないでしょうか？ 削除/引用 No.5009-1 - 2016/04/23 (土) 04:41:37 - ひー いつも拝見しては勉強をさせていただいております。 対象の遺伝子の中にアデニンをグアニンにするための変異導入を行いたいです。 変異導入のためのプライマーは一年ほど前に作られた物で、それが上手くいくことは分かっています。そのプライマーをフリーザーから解凍し、再び鋳型に対して変異導入を行おうとしたところ、上手く行きません。 実は今回の対象の遺伝子（一年ほど前にクローニングした遺伝子と同じものです）はpcDNA3.1+のEcoRVサイトに挿入しましたが、今回は逆向きに入っています。遇えてそのようにクローニングしています。 逆向きに入っているために、変異導入のプライマーがハイブリダイズできないのでしょうか？ 実験を行う前に自分で紙に書いて想像してみたのですが、きちんとワークするはず、と思っています。プライマーの保存は-20℃です。 コメントをいただけますと幸いです。宜しくお願い致します。

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