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(無題) 削除/引用 No.5676-8 - 2017/01/15 (日) 13:47:56 - WB おおさん、度々ありがとうございます。 固定、それはいいアイディアを聞きました。やってみる価値がありそうです。少なくとも水ゆすぎ→乾燥はぜひ試してみようと思います。 トランスファーの条件の違いは、極めて問題かもしれません。あまり大きい容器がないので、トランスファーバッファーを頻繁に作り直さなければならないんですが、段々面倒くさくなってきてボトルの目盛りで割とざっくりメタノールと10xバッファーを入れているので、これが多大なる影響を与えているのかもしれません。メタノールはかなり高濃度、40％にしています。 シグナルが得られなくなるよりずっと前からざっくり作っていたことと、転写直後のマーカー濃度は特に以前より薄くなった気はしないこととから問題ないかと思っていたのですが、ここがかなりクリティカルかもしれませんね。 また、メンブレンは長いロール製品を使っておりロットが変わったということはないんですけど、最近何だかメンブレンがパリッと割れてしまいやすくなった感があり、劣化しているのではないかと地味に気になっていました。これも原因の一つかもしれません（しかし、突然シグナルが極めて弱くなったのはパリッと感を感じてから後のことなので、これも特に主要因ではないんじゃないかと考慮から外していました）。その意味からも、やはりPVDFを一度試してみるべきですね。 色々アドバイスありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.5676-7 - 2017/01/15 (日) 13:22:53 - おお NCのロットが変わったとか古くなってきているというのはないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.5676-6 - 2017/01/15 (日) 13:21:49 - おお NCで低分子なら特にトランスファー後水などでゆすいて乾燥させてみるとシグナルが安定するかもしれません。更に固定をかますのもありかもです。私は0.025%グルタルアルデヒドに数分つけたりすることもあります。抗原性との兼ね合いもあるのでいつもそれでうまくいくとはが切らないですけど。 また低分子なのでトランスファーの条件の微妙な違いが大きく影響するかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.5676-5 - 2017/01/15 (日) 12:46:39 - WB おおさん、APさん、早速ありがとうございます。 言われてみればマーカー色素が薄くなるのは当然ではあるんですが、以前までは少なくとも最後まではっきりと（特に高分子側のものは）見えていたマーカーが、なぜか最近、検出時点で「あれ、裏表間違えたか？」と思えるぐらいにまで、ほぼ見えなくなるぐらいに薄くなってしまっている気がするので、（色素が突然今までより薄くなっているぐらいだから、ひょっとしたらサンプルも）ウォッシュで流されているのかなぁ、と思った次第です。ちなみにサンプルは極めて低分子（ペプチド）です。 しかしやはり別の要因ですかね。ECLはフェムトレベルの超高感度ので、まだまだ非常に新しい（とはいえ日が経つにつれ段々古くなっているのは当然ですが）ので、検出試薬は大丈夫ではないかと…。二次抗体もかなり新しいので大丈夫ではないかと…。 メンブレンは、実は以前PVDFと並列で比較して、NCの方がむしろシグナルが良かったので（扱いやすいということもありますし）ずっとNCを使っていたのですが、何か手がかりが得られるかもしれないのでPVDFでポジコンだけ流してみるのが良さそうですね。 念のため1回限りで隣のラボに下流の試薬も借りてみようかと思います。隣のラボはウェスタンヘビーユーザーであり、間違いなくワークしている試薬と思われるので、これもいいコントロールになりそうです。 とりあえず名回答者お二方が揃って「他の要因ではないか」とのことなので、基本に立ち返って各ステップ注意してみます。アドバイスありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.5676-4 - 2017/01/15 (日) 11:57:05 - AP 各社試供品はすぐくれるので試してみては

(無題) 削除/引用 No.5676-3 - 2017/01/15 (日) 11:50:40 - AP メーカーや製品によって差はありますが、転写直後よりマーカーが薄くなるのは当然と思っています。おそらく色素を抱合してあるだけで、共有結合してあるわけじゃないはずですから。洗浄後全く見えなくなるのもあったので、私は転写直後にマーカー位置に鉛筆で印をつけておくのを習慣としているくらいで。 マーカーが薄くなる現象とシグナルが検出できなくなった現象が本当にリンクしているのかは保留です。 もともとシグナルが微弱だったこと、NC膜を使っているということですので、より吸着能が高いPVDF膜にするだけで、うまくいきそうな気がします。

(無題) 削除/引用 No.5676-2 - 2017/01/15 (日) 11:31:57 - おお マーカーの色はWBをやっていく過程で薄くなっていくのは日頃から経験しています。なのでそれは特別変なことでもないのかなぁとおもっています。 シグナルが弱くなったということに関してはWBの一般的なチェックポイント全部が影響する要因ですのでかんたんにアドバイスするのは難しいです。ゲルの品質なども影響するでしょうし。 直接的原因としてあり得るものはECLキットなどが古くなってきてヘタってきたとか。２次抗体がヘタってきたとか言うのもあると思います。

ウェスタン、ウォッシュでシグナルが減ってる気がする 削除/引用 No.5676-1 - 2017/01/15 (日) 11:10:01 - WB 極めて弱いシグナルの検出を行っており、ポジコンですらシグナルが弱い悩ましい系を扱っているのですが、最近とみに（以前と比較しても）バンドが出なくなってしまいました。 気になった点として、特に最近、原因は不明なんですが、転写されたマーカーバンドの強さ（肉眼で見える青いバンド）が、ウォッシュ→二次抗体→ウォッシュでいざ検出の段階に至った時点で、高分子側含め転写直後と比較して異様に薄くなってしまっているような気がします（定量はしていませんが、見てはっきり「何でマーカーがこんな薄くなってるんだ？！」と思えるぐらい）。 TBSの作り間違いなどはないと思うのですが、何か突然シグナルが弱くなった時にありがちなミス・注意すべきポイント等ありましたらアドバイスいただけるとありがたいです。 メンブレンはニトロセルロースを使っています。

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