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(無題) 削除/引用 No.6250-3 - 2017/08/26 (土) 09:57:44 - けん坊 おおさん 早速のコメントありがとうございます。 詳しく書いておりませんでしたが、最初に編集効率が落ちた時点で、手元にあった2社のCas9を並べて追試しましたが、やはりゲノム編集は認められませんでした。そこで同じテンプレートで作りなおしたsgRNAを使用したところindelが確認できたので、Cas9の可能性はなかろうと考えました。 わかりにくい説明で申し訳ありませんでした。 そのほかにもアドバイスがあればぜひお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.6250-2 - 2017/08/26 (土) 09:49:31 - おお Cas9タンパクの方の安定性を疑わないのはなぜでしょうか。

sgRNAの保存と安定性 削除/引用 No.6250-1 - 2017/08/26 (土) 06:19:01 - けん坊 いつも勉強させてもらっています。 現在CRISPR/Cas9を用いたゲノム編集を行っています。 主にsgRNAとCas9タンパクをインキュベートして、RNPとした状態でエレクトロポレーションを行っています。 実験を繰り返す過程で、だんだんと編集効率が落ちてくることがわかりました。保存しているsgRNAを泳動しても、120bp付近で1本バンドに見えているのでRNAse混入によるDegradationではないと判断していたのですが、比較的最近生成した別ロットのものではしっかり編集されていました。sgRNAはすべてRNAse-free waterに溶解して-80度で保存していました。 おたずねしたいのは １）sgRNAの保存はどのようにされていますか？また活性はどのくらいの期間保たれていますか？ ２）泳動にて1本バンドとして見えていても活性が落ちているという経験をされている方はおられますか？ ３）末端の化学修飾で安定性が増すという論文が複数あるので、RNAse非存在下でも端の方が変性して活性が落ちる可能性があるのかと思っているのですが、妥当な解釈でしょうか？ ご経験のある方、ぜひアドバイスをいただければ幸いです。 よろしくお願い申し上げます。

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