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(無題) 削除/引用 No.6354-13 - 2017/10/02 (月) 19:27:25 - 転写因子 ごめんなさい、計算方法間違っていました。当たり前ですがどちらでも結果は同じですね。すみません。

(無題) 削除/引用 No.6354-12 - 2017/10/02 (月) 19:25:00 - 転写因子 おおさん、 レニラの値で割ると、確かに低くなりますね。 サンプル間でのレニラの比を求めて、ファイヤーフライの値と掛け算すれば、値はそれほど低くはならないと思いますが、その方法ではだめなのでしょうか。 たとえば、 サンプル1. ファイヤーフライ10000, レニラ100000 サンプル2. ファイヤーフライ15000, レニラ200000 これを補正すると サンプル1. 10000 サンプル2. 30000 となりますよね。 けど、割り算すると、 サンプル1. 0.1 サンプル2. 0.075 となり、値は低くなりますよね。どちらの換算方法が正しいのでしょうか。 微妙に結果の比も違っていますね。。 EMSAのご説明、ありがとうございます。理解できました。

(無題) 削除/引用 No.6354-11 - 2017/10/02 (月) 14:17:42 - おお >[Re:10] 転写因子さんは書きました : > 結構高いというのがよく理解できていませんが、きちんと正しい材料を揃えてまずはやってみて、その後、おお様やmon様からいただいたコメントを読み直し、理解をすることにします、ありがとうございます。 Renillaはしっかりとした発現するので（カウントで１万とか）、それでわって１０とすると割る前の実際のカウントは１０万ということになりますから。 > > もしかしたらWT、KO、KOのXの過剰発現したものの核抽出蛋白でEMSA（Gel shift assay)してみるとなにかきっかけが見つかるかも。 > > EMSAに関しては、おおさんのご指摘をきちんと理解していませんが、一度何がそこから言えるのか考えてみます。詳しくコメントをいただき、ありがとうございました。 > つまり、KOで過剰発現したものからEMSAで検出される蛋白、DNA複合体とWTでで検出される複合体が違って移動度の違いで見れないかということです。

(無題) 削除/引用 No.6354-10 - 2017/10/02 (月) 10:07:37 - 転写因子 おおさん、度々、ありがとうございます。 >[Re:6] おおさんは書きました : > >エピゾーマルな発現なので、一過性の発現ではその可能性は低いと思う。 > > それも考え方なんだけど、プラスミド導入してNucleosome assemblyを見るとかそんな実験もあるんではなかったかな。。。 > > > それと指摘があるように、normalizeしているか私も不思議に思いました。というのは５０とか１００とかあたかもルシフェラーゼの活性のカウントのように見えるので。 はい、おっしゃる通り、実際のカウントになります。 今後、Renillaでノーマライズする方法としては、まずサンプル間でのRenillaの活性を一致させて、その時のfireflyの活性を示すことがノーマライズになりますよね。 たとえば、 サンプル1：Rellila 10, Firefly 20 サンプル2：Renilla 5, Firefly 20 ならば、ノーマライズ後のFirefly活性はサンプル2で２倍高い、と言えばいいのですよね。 示された数字がnormalizeされたものなら私のコメントのカウントが１０００だとかいうのは当てになりません。同時にDual Luciferaseでnormalizeされた計算値なら、５０にしても１００にしても結構高い数字です(単純に割り算した数字なら)。 結構高いというのがよく理解できていませんが、きちんと正しい材料を揃えてまずはやってみて、その後、おお様やmon様からいただいたコメントを読み直し、理解をすることにします、ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.6354-9 - 2017/10/02 (月) 10:02:29 - 転写因子 ん？さん、monさん、 > エピゾーマルな発現なので、一過性の発現ではその可能性は低いと思う。 おっしゃる通りです。ありがとうございます。 実はDualでnormalizeはしていないんです。。 ただ、隣のwellでGFPだけを導入し、それをFACSすることで導入効率を見積もって、normalizeをしています。luciferase assayを始めたばかりでしたので、そこまで用意ができませんでした。今はRenilla luciferase plasmidが手に入ったのと、dual用の試薬を発注しましたので、今後きちんとnormalizeしようと思っています。 transfection効率はGFPのFACSで大体同じくらいでした。 pRL-TK (hTK-driven Renilla Luciferase)を今後normalizeに使っていきます。 >[Re:5] monさんは書きました : > Dual Luciferaseアッセイでtransfection効率はnormalizeしていますよね。 > していないとtransfection効率が違うだけかもしれません。 > しているなら、KO細胞と野生型細胞で、normalizeする方のLuciferaseシグナル強度は同等ですか？ > 同等でないとすると、こちらの影響で見かけの（normalizeした：BKを引いてさらに割り算した）Luciferase強度が変わって結果の解釈を誤ることがあります。 > normalizeする方のluciferaseコンストラクトも新しいもの（細胞種による影響をうけづらい）が出ていますし。pGL4-TKだったかな？

(無題) 削除/引用 No.6354-8 - 2017/10/02 (月) 09:58:35 - 転写因子 おおさん、ありがとうございます。 > Chipアッセイの細胞とルシフェラーゼで使った細胞は一緒ですか？ > KOとWTでYの蛋白、mRNAの発現はどれくらい差がありますか？ はい、一緒の細胞を用いています。 KOとWTでYのタンパク質はWTが10だとすると、KOでは1か2ほどです。 mRNAに関しては、WTが10だとすると、KOでは5です。 > Yを発現するその他の細胞でルシフェラーゼアッセイをしたことがありますか？ 私の扱っている細胞は人線維芽細胞なのですが、XのKO線維芽細胞でのみ、Yのluciferase活性がXの共発現で誘導されますが、その他の細胞ですと、NIH3T3や293Tでは、Xを強制発現させてもYは誘導されませんでした。XのKO線維芽細胞へXの強制発現では、Yは50倍mRNAが増加します。 ちなみに人とマウス間でXのアミノ酸配列は95%以上identicalです。 > まず野生型で機能するレポーターを作るべきではないかなと。更に上流の配列も含んだコンストラクトとか作るべきなのかもしれません。 おっしゃる通りです。 ただ当初2 kbほどYのTSSから上流のクローニングを挑んでいましたが、成功せず、唯一うまく行った1 kbほどのプロモータでアッセイしています。今週、BACが届くので、それを鋳型に2 kbほどをクローニングして、野生型細胞でまずは出るべきものがでるコンストラクトを完成させようと思います。 > もしかしたらWT、KO、KOのXの過剰発現したものの核抽出蛋白でEMSA（Gel shift assay)してみるとなにかきっかけが見つかるかも。 EMSAに関しては、おおさんのご指摘をきちんと理解していませんが、一度何がそこから言えるのか考えてみます。詳しくコメントをいただき、ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.6354-7 - 2017/10/02 (月) 09:49:12 - 転写因子 momさんありがとうございます。 >[Re:2] monさんは書きました : > まず、"Empty plasmid"も"Luciferase plasmid"もLuciferase geneは乗っているハズなので、"Empty plasmid"= "promoter-less (luciferase) plasmid"、"Luciferase plasmid"="Y promoter-driven (luciferase) plasmid"等と表現すべきです。 おっしゃる通りです。そのように改めます。混乱を生じさせる書き方で申し訳ありません。 ありがとうございます。 > 「KO細胞と野生型細胞の間で、齟齬が生じており」について、 > 例えば、野生型細胞では、X転写因子は（刺激等がなければ）通常不活性化されている可能性（Xタンパクに修飾等がなくても局在が異なる可能性）があります。 > この場合、KO細胞でも一過性発現されたX転写因子も不活性化されそうですが、常時Xが無い状態が続いているため、X不活性化メカニズム自体が（不要なため）不活性化されているのかもしれません（理由になっているような、なっていないような？）。 > Y promoterが不活性化されているされている可能性も考えられますが、一過性遺伝子導入でもluciferase活性がBKレベルことを考えると、考えずらい（promoterの不活性化：メチル化は時間がかかるため） > 他にも考えられると思います（他力本願）。 なるほど、KO細胞で本来動くはずに抑制性の機構が動いていないという可能性はありますね。 なるほど。ありがとうございます。 > 例えば、野生型細胞では、X転写因子は（刺激等がなければ）通常不活性化されている可能性（Xタンパクに修飾等がなくても局在が異なる可能性）があります。 実はこの転写因子は通常、核外（ライソゾーム膜）に存在しており、とある刺激によって核内に移行します。 今回私は膜結合型（full length）ではなく、核型のtruncatedな転写因子を導入しています。 また論文ではこの転写因子は通常、ubiqutin proteasomeで恒常的に分解されているようです。 momさんのご指摘の鋭さに畏怖の念を感じるとともに、自分の考えの未熟さを知りました。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.6354-6 - 2017/10/02 (月) 08:09:44 - おお >エピゾーマルな発現なので、一過性の発現ではその可能性は低いと思う。 それも考え方なんだけど、プラスミド導入してNucleosome assemblyを見るとかそんな実験もあるんではなかったかな。。。 それと指摘があるように、normalizeしているか私も不思議に思いました。というのは５０とか１００とかあたかもルシフェラーゼの活性のカウントのように見えるので。示された数字がnormalizeされたものなら私のコメントのカウントが１０００だとかいうのは当てになりません。同時にDual Luciferaseでnormalizeされた計算値なら、５０にしても１００にしても結構高い数字です(単純に割り算した数字なら)。

(無題) 削除/引用 No.6354-5 - 2017/10/01 (日) 16:23:12 - mon Dual Luciferaseアッセイでtransfection効率はnormalizeしていますよね。 していないとtransfection効率が違うだけかもしれません。 しているなら、KO細胞と野生型細胞で、normalizeする方のLuciferaseシグナル強度は同等ですか？ 同等でないとすると、こちらの影響で見かけの（normalizeした：BKを引いてさらに割り算した）Luciferase強度が変わって結果の解釈を誤ることがあります。 normalizeする方のluciferaseコンストラクトも新しいもの（細胞種による影響をうけづらい）が出ていますし。pGL4-TKだったかな？

(無題) 削除/引用 No.6354-4 - 2017/10/01 (日) 16:12:43 - ん？ 〉野生型細胞とX KO細胞では標的遺伝子Yのヒストンアセチル化の程度が違っていたりするのでしょうか。 エピゾーマルな発現なので、一過性の発現ではその可能性は低いと思う。

(無題) 削除/引用 No.6354-3 - 2017/10/01 (日) 15:51:01 - おお 野生型で、活性が強くないのは不思議ですね、、、 Chipアッセイの細胞とルシフェラーゼで使った細胞は一緒ですか？ KOとWTでYの蛋白、mRNAの発現はどれくらい差がありますか？ Yを発現するその他の細胞でルシフェラーゼアッセイをしたことがありますか？ バックグランド、ベーサルの活性の読みが５０とかというのが気になります。というのはエンハンサーレスのルシフェラーゼでも私の昔やった系では１０００以上ありましたから。導入効率を改善したらもしかしたら見れなかった活性が見れるようになる可能性はあるんじゃないかな。まあ検出系は様々なので単純にカウントで比較は難しいですけどね。 テクニカルに問題がないなら、いくらかHypothesesをたててみるのがいいかと。 Yの発現によるXの蛋白レベルでのネガティブフィードバック。ただしYがしっかりと発現しているならプロモーターの違う部分に（おそらくYによりポジティブに制御されている）別のタンパク質がYの転写を活性化している可能性。またはXがルシフェラーゼにつなげた部分以外にアクセスしている可能性。例えば同じ転写因子が結合する部位が複数ある遺伝子は少なくはない。 そんなことを考えていると、Yの上流の領域を入れたそのレポータープラスミドは、野生型で機能してないのでそれを使うというのは（こんなこと言って申し訳ないですが）ストラテジーとしてあまり良くないような気がしてきたのですが、、、 まず野生型で機能するレポーターを作るべきではないかなと。更に上流の配列も含んだコンストラクトとか作るべきなのかもしれません。 加えて、転写っていろいろなことがわかってきているのでいろんな可能性が考えられるかもしれませんがXがYプロモーター、エンハンサー領域のメチレーションの制御に関わっていて、直接プロモーターを活性化しないとか、、、んでもこれはKOの実験の結果では矛盾が生じますね。 もしかしたらWT、KO、KOのXの過剰発現したものの核抽出蛋白でEMSA（Gel shift assay)してみるとなにかきっかけが見つかるかも。

(無題) 削除/引用 No.6354-2 - 2017/10/01 (日) 06:52:51 - mon まず、"Empty plasmid"も"Luciferase plasmid"もLuciferase geneは乗っているハズなので、"Empty plasmid"= "promoter-less (luciferase) plasmid"、"Luciferase plasmid"="Y promoter-driven (luciferase) plasmid"等と表現すべきです。 「KO細胞と野生型細胞の間で、齟齬が生じており」について、 例えば、野生型細胞では、X転写因子は（刺激等がなければ）通常不活性化されている可能性（Xタンパクに修飾等がなくても局在が異なる可能性）があります。 この場合、KO細胞でも一過性発現されたX転写因子も不活性化されそうですが、常時Xが無い状態が続いているため、X不活性化メカニズム自体が（不要なため）不活性化されているのかもしれません（理由になっているような、なっていないような？）。 Y promoterが不活性化されているされている可能性も考えられますが、一過性遺伝子導入でもluciferase活性がBKレベルことを考えると、考えずらい（promoterの不活性化：メチル化は時間がかかるため） 他にも考えられると思います（他力本願）。

転写制御に関する疑問 削除/引用 No.6354-1 - 2017/10/01 (日) 03:31:51 - 転写因子 いつも勉強させていただいています。 最近、ルシフェラーゼアッセイを始めたものです。 データの解釈につき、疑問に思うことがあり、皆様のご意見をお聞きしたく、トピックを立てました。 宜しくお願いします。 始めに仮説として、ある転写因子Xは標的遺伝子Yの発現を正に制御します。 その根拠は、 1.　XのChIPによってYのプロモータが検出されたこと。 2.　Xのノックアウト細胞を作製したところ、YのmRNA、タンパク質共に野生型細胞に比べ、有意に減少していた。 3.　Yのルシフェラーゼプラスミドを作製し、Xのノックアウト細胞に導入すると、Xの共発現により優位にルシフェラーゼ活性がバックグラウンドに比べ、2000倍増加すること。また、Xの共発現なしでは、バックグラウンドに比べ、2倍程度増加しました。 以上です。 ところが、そのルシフェラーぜプラスミドを野生型の細胞に導入すると、仮説ではXの共発現無しでもルシフェラーゼ活性が高く認められるはずでしたが、バックグラウンドと変わらずでした。さらに不思議なことに、Xの共発現をしたところ、2倍程度の増加程度で、ほぼバックグランドと変わらずでした。 これまでに野生型細胞でXのRNAiノックダウン実験は行ったことはありません。 やや複雑な話ですので、下に具体的に6サンプルの値をしめします。 1.　野生型細胞、Empty plasmid only: Luciferase activity = 50（バックグラウンド） 2.　野生型細胞、Luciferase plasmid: Luciferase activity = 50（仮説では1に比べ、うんと増加するはずでした。） 3.　野生型細胞、Luciferase plasmid + X plasmid: Luciferase activity = 100 4.　X KO細胞、Empty plasmid only: Luciferase activity = 50（バックグラウンド） 5.　X KO細胞、Luciferase plasmid: Luciferase activity = 100 6.　X KO細胞、Luciferase plasmid + X plasmid: Luciferase activity = 10000（これは仮説通りです。） 以上のことから、X KO細胞と野生型細胞の間で、齟齬が生じており、私の仮説はあくまでX KO細胞の細胞において適用されるものかもしれません。野生型細胞とX KO細胞では標的遺伝子Yのヒストンアセチル化の程度が違っていたりするのでしょうか。野生型細胞ではXに代わる転写因子が働いている可能性は十分ありますが、ですが、野生型細胞に比べ、X KO細胞ではYのmRNA、タンパク質共に減少していることと矛盾が生じています。 考えに煮詰まってしまい、ここで皆様の可能性のある解釈をお聞かせいただけますととても参考になります。 稚拙な文章でわかりずらいところがあると思いますが、その際はご指摘いただければ修正、加筆いたします。 どうぞ、よろしくおねがいいたします。

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