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(無題) 削除/引用 No.6368-14 - 2017/10/13 (金) 15:02:12 - A その後、なにをして、どういう結果がでました？

(無題) 削除/引用 No.6368-13 - 2017/10/06 (金) 13:43:10 - AP 部分変性で100％のプラスミドが切れなくなることがまず無いように、夾雑物のために100%切れなくなるということも稀だと思いますが。Xho1もHind3も夾雑物には強くて、精製度が悪くても（例えばボイル法）効きますし。 フェノール抽出は除タンパク質の他に、renatureの効果があるそうなので（有機層と水層の界面でrenatureが促進される）、そういう面からも制限酵素感受性を高めることができるのかも。

(無題) 削除/引用 No.6368-12 - 2017/10/06 (金) 11:20:07 - 中年 HindIIIとXhoIサイトも含めてシーケンスが確認されているなら、問題はミニプレップしたプラスミドに制限酵素反応を邪魔するものが夾雑しているんでしょう。 制限酵素処理で0.5kbの切断断片が確認できないとのことですが、それではどういう泳動パターンですか？uncut？one cut？制限酵素処理していないプラスミドと並べて泳動してみれば容易に区別できますよね。慣れていればバンドの形状を見るだけで区別できますが。

(無題) 削除/引用 No.6368-11 - 2017/10/06 (金) 11:17:42 - 制限酵素 > ミニプレップは市販キット？ いえ、自作のものです。P1 ~P3後のエタチンのみです。 > シークエンスは本当に両端の制限酵素配列まで確認できました？ はい、読めました。二度確認したので間違いないです。 > プライマーにいくつ付加しましたか？ プライマーには5'側に4bp余分につけています。 > サテライトどうのこうのもあるみたいだし、なんであれミディの前にもう一回純化させて、再度シークエンス・制限酵素切断確認してみたら？ やはりそうした方がいいでしょうか。。。 monさん、ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.6368-10 - 2017/10/06 (金) 11:14:38 - 制限酵素 APさん、ありがとうございます。 サンプル数は8つだったので、一度にマニュアルでP!, P2, P3後にエタチンだけなのですが、多少オーバーに アルカリ変性されてしまったのか？とも疑えなくもないですが、いつも同じようなサンプル数をこなしているので、少し考えにくいです。。 >[Re:6] APさんは書きました : > シークエンスがOKならそれ以上の証明はないでしょう。 > > 精製時のアルカリ処理が過剰で部分変性しているとプラスミドが制限酵素で切れなくなります（ghost bandとして知られる）。キアゲンの資料ではありえるトラブルとして触れています。ただ、プラスミドの一部がそれによって制限酵素耐性になることはよくあっても、全部が切れなくなるってことはあんまりないんですけれどね。よっぽどアルカリ処理が過剰だったか？ > > あとはメチル化の影響で切れなくなる場合がありますが、Hind3はメチル化非感受性、Xho1はGCメチレースによるメチル化には影響されますけれど、PCRや大腸菌では起こりません。

(無題) 削除/引用 No.6368-9 - 2017/10/06 (金) 11:11:38 - 制限酵素 皆様ありがとうございます。 > すんません、HindIIIとXhoIサイトに入れたのであって、その酵素でカットして確認したわけではなかったみたいですね。 > 確認に使用した酵素はなんでした？ 確認に使用した酵素はHind3とXho1です。 > 配列はプラスミドから直接読んだのでしょうか？ はい、配列はpGL3 basicのバックボーン側から読んでいます。 念のためにMCSの5'側と3'側からの両方向から読みましたが、いずれも綺麗に読めています。

(無題) 削除/引用 No.6368-8 - 2017/10/06 (金) 10:01:05 - A > シークエンスがOKならそれ以上の証明はないでしょう。 うーん、でもなんか腑に落ちませんよね。 ミニプレップは市販キット？ シークエンスは本当に両端の制限酵素配列まで確認できました？ あと、個人的経験としてXho配列を付けたプライマーからのPCR産物をダイレクトカットするのは数bp余分に付けた程度では至難の業なのですが、プライマーにいくつ付加しましたか？ サテライトどうのこうのもあるみたいだし、なんであれミディの前にもう一回純化させて、再度シークエンス・制限酵素切断確認してみたら？

(無題) 削除/引用 No.6368-7 - 2017/10/06 (金) 09:50:57 - mon ミニプレップ産物に不純物が多いと制限酵素での切れが悪いときがあります。 フェノクロ処理＞EtOH沈殿等で不純物を減らすと格段に切れが良くなります。 制限酵素処理する際にBSAを添加するだけで改善する場合もあります。 「ミニプレップ時にアルカリ変性をしすぎると酵素が切れなくなる」のは事実ですが100％アルカリ変性したままで無い限り切れますので、せいぜい切れ残りが出るくらいが現実です。ミディプレップもアルカリSDS法を使いますので、気を付ける点は同じです。

(無題) 削除/引用 No.6368-6 - 2017/10/06 (金) 09:46:43 - AP シークエンスがOKならそれ以上の証明はないでしょう。 精製時のアルカリ処理が過剰で部分変性しているとプラスミドが制限酵素で切れなくなります（ghost bandとして知られる）。キアゲンの資料ではありえるトラブルとして触れています。ただ、プラスミドの一部がそれによって制限酵素耐性になることはよくあっても、全部が切れなくなるってことはあんまりないんですけれどね。よっぽどアルカリ処理が過剰だったか？ あとはメチル化の影響で切れなくなる場合がありますが、Hind3はメチル化非感受性、Xho1はGCメチレースによるメチル化には影響されますけれど、PCRや大腸菌では起こりません。

(無題) 削除/引用 No.6368-5 - 2017/10/06 (金) 09:44:39 - DMR すんません、HindIIIとXhoIサイトに入れたのであって、その酵素でカットして確認したわけではなかったみたいですね。 確認に使用した酵素はなんでした？

(無題) 削除/引用 No.6368-4 - 2017/10/06 (金) 09:39:28 - おお ＞アルカリ変性をしすぎると酵素が切れなくなる そういうことのような気がしますけど、もしそうならミディプレップで調製して目的のプラスミドを精製することはできるでしょうけど、盲点かもしれないと思うのは制限酵素で目的のプラスミドかどうか確認できていないところ。配列はプラスミドから直接読んだのでしょうか？ メチレーションに関してはおそらく気にしなくてもいいかと思います。 ttps://www.neb.com/products/r0104-hindiii HindIII Methylation Sensitivity dam methylation: Not Sensitive dcm methylation: Not Sensitive CpG Methylation: Not Sensitive ttps://www.neb.com/products/r0146-xhoi XhoI Methylation Sensitivity dam methylation: Not Sensitive dcm methylation: Not Sensitive CpG Methylation: Impaired CpGは大腸菌とかには見つかってないのでは？

(無題) 削除/引用 No.6368-3 - 2017/10/06 (金) 09:06:21 - 制限酵素 DMRさんありがとうございます。 実はもともとのプラスミドを鋳型にトランケーション変異体を4つ同時に作ったんです。 両末端はもともとのプラスミドと同じで、HindIII と XhoI です。 ミニプレップ後、シークエンスして4つとも正しいことを確認しつつ、念のため制限酵素チェックしたところ、切れませんでした。ただ、同時にもともとのプラスミドはきちんと切れています（こちらはミディプレップで調製したものです）。 ミニプレップ時にアルカリ変性をしすぎると酵素が切れなくなる、との書き込みがありましたので、もしかしたらそれかな？と考えていますが、そういった場合、ミディプレップで調製したら問題なくなるものでしょうか。あるいは、やはり何かがおかしいのでしょうか。 >[Re:2] DMRさんは書きました : > HindIII も XhoI もメチル化あるよ。別の酵素で切ってみたら？

(無題) 削除/引用 No.6368-2 - 2017/10/06 (金) 08:54:17 - DMR HindIII も XhoI もメチル化あるよ。別の酵素で切ってみたら？

配列はあるのに制限酵素でミニプレッププラスミドが切れません 削除/引用 No.6368-1 - 2017/10/06 (金) 06:22:04 - 制限酵素 質問させてください。 pGL3ベーシックプラスミドに、0.5kbのある遺伝子のプロモータをXho1とHind3でクローニングしようとしています。 PCRはしっかりかかり、ゲルからの切り出し（UV照射は3秒以内）、回収率はいいです。 ミニプレップから調整したベクターを同じ酵素で切断しつつ、PCR産物も同じ酵素で1時間切断しました。 その後、ベクターはゲルからの切り出しを行い、PCR産物に関してはキアゲンのPCR精製カラムで精製しました。 その後、ライゲーション（1時間、室温）を行い、自作DH5αに形質転換し、アンピシリンを含むLBプレートで一晩37℃で培養しました。 翌朝、シングルコロニーをピックし、ミニプレップを行ったものを、シークエンス解析しました。 結果、全て目的の物が期待した制限酵素サイトに挿入されていることを確認できました。 一応念のため、そのミニプレップ産物を制限酵素処理し、目的の0.5kbが出て来るかをみたところ、不思議なことに0.5kbのバンドが現れませんでした。 思い返せば、不思議なことにLBプレートにはサテライトよりもずっと小さい斑点が一面に生えていたことも気になりますし、本当にこのミニプレップ産物が目的のものなのかどうかが疑わしいです。 もう一度このミニプレップ産物を形質転換し直し、シングルコロニーをピックしたら何か変わるでしょうか。 あるいは、制限酵素で切れないというのはミニプレップ産物ではよくあること？で、気にせずミディプレップを進めてそれで制限酵素で切れるかどうかをみるべきでしょうか。 約1週間、クローニングに時間を費やしており、どうにかシークエンサーで目的の物が得られたのでどうにか先に進めたい、このサンプルを捨てたくない、おかしなところがあれば、ここから挽回したいと思っています。 思っているだけで具体案はないのですが、こういったことは多々あるものなのでしょうか？ よろしくお願いいたします。

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