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(無題) 削除/引用 No.6557-25 - 2018/01/12 (金) 12:21:21 - KY 度々あげてしまい、恐縮しております。 だいぶ可溶性画分にタンパク質を回収できるようになりました。 ケースバイケースだとは思いますが、一応参考まで。 温度は20、25、30度で検討しましたが、4時間後、12時間後それぞれのOD600は、温度があがるにつれ、また、時間が長いほど当然ですが、増加しました。 この時の可溶性画分の量は、20度でいずれの時間でも認められず、また、25度よりは30度の方で増加していました。30度で培養した際の時間の違いは（なぜか？）認められませんでした。もしかしたら可溶化力に限界が来ていたのかもしれません。 以下が可溶化までのプロトコルです。 50mlチューブで培養していた大腸菌（10ml）を5000g、8分遠心。デカント後、冷50mMトリスpH8を10ml加え、転倒混和後、再度遠心。その後、デカント。 1mlの冷50mMトリスpH8をベースに、リゾチームを100ug/mlの濃度で加え、氷上30分。この時、ライセートがかなり粘性を示していることを確認しています。その後、DNase　50 ug/mlの濃度で加え、さらに1％TritonX100を加え、氷上でさらに1分。この時、先ほどの粘性が綺麗になくなったことを確認しています。（これを溶解バッファーとします。蛋白質分解酵素阻害剤カクテルは加えています。） その後、20000g、5分で遠心後、かなり多めのペレットが見えたので、もしかしたらまだ大腸菌が完全に壊れていないのか？と考え、ペレットを形成させたまま超音波処理をしました。1分ほどするとペレットは消失していました。最後遠心するとそれでも同じほどのペレットができていたので、さらに2分行い、遠心を行いました。 結果、それでもペレットはあまり壊れていない様子でしたので、そのまま上清を取り、グルタチオンビーズにて精製に行きました。結果は冒頭の通りです。 今回はGE様のプロトコルにしたがい、適切なボリュームの溶解液にて適切な量のバクテリアを壊しました。 ややそれでも分解物は多いので、これはこの後ヒスタグベージョンを作成しますので、そこで除くとして、 できるだけ温度を上げる操作は避けたいです。そこでお聞きしたいのですが、超音波処理は上記プロトコルで必要でしょうか？超音波の有無でペレット（ほとんどが封入体？）が小さくなっているわけでもなさそうです。もし効果がなく、闇雲に温度を上げる原因になるだけなのなら必要ないかと思います。ソニケーションも目的がゲノムの剪断というだけなら必要ないですよね。ただソニケーションのステップにより細菌の可溶化が促されるようなら、行いたいです。（ソニケーションの有無で調べたらいいのですが、、、） もう一つの質問は、可溶化バッファーには150mMほどの塩はいりますでしょうか？ 入れた方がイオン強度があり、良いかなとは思いますが、参考にしているものにはかかれてありませんでした。 アップデートだけでなく、質問を加えてしまいましたが、お手すきの際で結構ですので、また宜しく御願い致します。

(無題) 削除/引用 No.6557-24 - 2018/01/11 (木) 12:37:53 - KY おお様、むねあつ様、 GSTが多量体を形成することは恥ずかしながら知りませんでした。 特段そのような性質が私の実験に影響することは予想していませんが、ゲル濾過は適用外となることは理解でsきました。ありがとうございます。 また、むねあつ様、ゲル濾過担体につき、大変詳しい説明をしていただきありがとうございました。 昨日から一冊ゲル濾過の冊子を読みました。ご説明していただいた意味がようやく理解できましたし、ゲル濾過担体は基本的に不反応（inert）であること、ゲルのポアが重要であることを理解しました。 第二のタグとして、C末にhisx6タグをつけることにいたしました。 また、イオン交換は一度過去に行ったことがありますので、sephadex A-50がありましたので、それで一度検討してみることにします。ありがとうございます。

ゲルろ過 削除/引用 No.6557-23 - 2018/01/09 (火) 19:02:01 - むねあつ 横さん Sephadex G-25 またはG-50の分画範囲はそれぞれ1-5kDaと1.5-30kDaなので25kDaと48kDaの混合物は通常いずれもほとんど担体のゲルの中へ入っていかないため分離することはゲルろ過の分離モードでは可能ではありません。どうしてもSephadexというならG-75またはG-100でないとそもそもゲルの中へ入っていかないのです。（余談ですがこれらの担体はもっと小さな分子の分画や脱塩とかバッファー交換には非常に便利に使えます。小生もG-25を愛用しております。） おおさんご指摘のようにオリゴマーを形成する酵素の場合は、SDS-PAGEで単量体の単一バンドに見えていてもゲルろ過カラム上では複数のピークに分裂することがよくあります。 この理由でGSTタグのみの25kDaと欲しいものと融合した48kDaを分離する手段としては（たとえ分離に最適なクロマトグラフィー担体が使えたと仮定しても）あまり良い手筋ではなさそうです。 先に議論されていたように完全長のタンパク質だけ精製してくるための第二のタグが利用できない場合は GSTの等電点と融合させた部分の等電点がかなり違っているのであれば、イオン交換クロマトグラフィーを試すのがオーソドックスではないかと思います。

(無題) 削除/引用 No.6557-22 - 2018/01/09 (火) 12:34:32 - おお >[Re:20] おおさんは書きました : > あ、Cterm単独のタグで十分か、 あ、ごめん十分とまではいえないですね。Ntermが削れたものが取れる可能性を考えると。

GST fusion proteinのassay 削除/引用 No.6557-21 - 2018/01/09 (火) 12:06:00 - むねあつ GST-tagは発現タンパクを可溶性にしてくれることが多いので大変有用ですが、 大部分が不溶性画分に回収される場合はタグの利点が活かし難くなります。 GE(元Pharmacia)のGST Gene Fusion System Handbookに簡単な活性測定法(CDNB法)が載ってます。（p66あたり、なんか絶版になっとるような様子ですがnetで探せばそこら中に落ちてますのでご心配なく。）ちょっと毒性のあるCDNBを使う必要はありますが、340nmの使える分光光度計だけでGSTの活性が測れますので、可溶化の程度を見積もるのに大変便利です。通常は1minの測定で精製過程の追跡に十分な精度のデータが取れますし並行してタンパク定量も行えば、比活性もわかります。 酵素学全盛期の大先輩たちは、活性を指標に精製を進めていたので、「安くて早くて美味い」活性測定方法の存在が同じ時間ハードワークをしても全然質と量の違うデータを生み出す鍵だとくどくど説明するまでもなく理解していただけるのですが、組換えタンパク世代以降は、cDNAさえあれば（あるいは合成すれば）活性もfoldも関係なく実験に必要なタンパクを入手できるようになったので、若い方々への文化継承が上手くいっていないようです。（これは日本国内に限らず言えることだと感じております。） GST活性を測定すればGSH affinity resinに結合するかどうかもたちどころにわかりますし、SDS-PAGEの結果が出るまで何が起こっているかわからずブラインドで実験を進める必要もありません。もちろん貴重な活性画分を失ってしまうことも防げます。 変性前提であればHis-tagの利用が有効です。 nativeのc-termが必須でなければ、おおさんご指摘のようにc-termにhisなどの別の精製タグを付ければ完全長のタンパク質を簡便に精製できます。

(無題) 削除/引用 No.6557-20 - 2018/01/09 (火) 10:06:32 - おお あ、Cterm単独のタグで十分か、

(無題) 削除/引用 No.6557-19 - 2018/01/09 (火) 09:33:24 - おお GST自体が多量体になるので、GSTホモDimerで５０kDａぐらい、GST-fusionで５０KDaくらいならGSTを介したダイマーで１００kDa、場合によってはGSTとGST-fusionのヘテロで７５kDaのサイズのものがゲルろ過ならあらわれるかもしれないということですSDSPAGEでは変性されてしまって複合体はまず見れないでしょう。 中途半端なプロダクトができるのは複数理由があると思うけど、Translation自体が途中でストップしてしまったり、全長ができたあとにプロテアーゼのアタックをうけるとか。確かに温度を低くすればプロテアーゼの活性もある程度抑えられるだろうーと言うことでそういう方法も取られるのかと（他の理由もあるけど）。ただ方法論的にも完璧に抑えれるとはいいきれないでしょう。 中途半端なものが実験でどうしても邪魔なときは、C-termになにかGST以外のタグをつけてタンデムに精製すれば方法論的にもスッキリとすると思う。ただヘテロで複合体になっているものは問題になるかもしれないので、C-termタグで精製のとき少し工夫が必要かと思う。

(無題) 削除/引用 No.6557-18 - 2018/01/08 (月) 08:16:59 - KY 横さん、おおさん、 実は私もGST融合目的タンパク質の他に、GST単独と思われるバンドがグルタチオン精製後に認められます。 比率で言うと、GST融合目的タンパク質が1とした時に、GST単独が3か4ほどの量を持って精製されてきています。 精製前のインプットも流していますが、GST融合目的タンパク質の圧倒的な発現があるのですが、GST単独のバンドはそれほど強くはありませんので、もしかしたら精製途中で分解されてGSTが取れてしまったか、わずかに大腸菌で発現していたGSTが優先的に精製されてしまったかを考えています。 私自身GST融合タンパク質を作製したのはこれが経験的に2度目です。 確か前回の時もGST単独のバンドがGST融合目的タンパク質の他に出てきていましたが、その時はそれでも構わず実験を進めていました。 今回の蛋白質はモノマーでは48kDほどに出るはずで、実際、そのようなバンドになっています。 ダイマーが形成されるかどうかまではわかりません。 ちなみにGST単独を発現させた大腸菌から同じように精製すると、25kDのバンドのみが現れますので、48kDのバンドはGST自身のダイマーではないと考えています。 今回、精製のステップは全てコールドルームで、試薬、バッファーも全て用事調製し氷冷していました。 もったいないですが、高いプロテアーゼ阻害剤も入れたのですが、これほどまでにGST単独のバンドが強いとは思いませんでした。 今考えていることとしては、IPTGで誘導する際、30度は高すぎなのでは？と考えています。これを25度にまで下げて（18度ではそもそも発現しませんでした。）誘導しようかと考えています。 おおさんは過去に同じようにGST融合目的タンパク質を作製した際、GST単独と思われるバンドのco-purifyに悩まされたことはありませんでしょうか？ お手すきの際にご教示いただけますと幸いに存じます。

(無題) 削除/引用 No.6557-17 - 2018/01/06 (土) 16:02:04 - おお ダイマーになってるんじゃないっけ？それを考慮に入れると２５も５０も排除限界に来るんじゃないかな。ダイマーもヘテロになっているやつもあるかも。

(無題) 削除/引用 No.6557-16 - 2018/01/06 (土) 15:45:03 - 横 横からすみません。 ゲル濾過クロマトグラフィに興味があります。 GST fusion proteinを作ってますが、精製後、48 kDaと25 kDaのタンパク質がみられました。 たぶん25 kDaはGST fusion proteinの分解産物（GSTそのもの？）だと思います。 そこでどうにか48と25を分離できないか考えてますが、ゲル濾過というものはこの目的を果たせそうでしょうか？うちのラボにSephadex G-25か、G-50があったはずです。

(無題) 削除/引用 No.6557-15 - 2018/01/06 (土) 07:43:42 - KY WInter-8様、おお様、 ありがとうございます。 昨日確認しました。6Mで封入体を可溶化したのち、4Mに落とし、そこへグルタチオンビーズを加え、数時間後、4M尿素でビーズを洗浄し、そのビーズにSDSサンプルバッファーを加えることできちんと結合していたことを確認しました。 一つ質問を重ねてもよろしいでしょうか？ 4M尿素存在下で目的タンパク質をビーズに結合させています。 ここからの操作なのですが、 1.　4M尿素に、還元型グルタチオンを加えることで結合タンパク質をカラムから溶出する。その後、透析なりのリフォールドを試す。 2.　4M尿素存在下で目的タンパク質を結合させていますが、そこから3.5M、3M、2.5M、2M、1.5M、1M、0.5M、0Mと順に尿素を落としていき、最終的に尿素フリーのバファーに還元型グルタチオンを加えて目的タンパク質を溶出する。 このふた通りを考えています。 が、先の実験で（このトピ内の最初の方に書きましたように）PBSでビーズを洗うとせっかく結合していたGSTタンパク質が外れてしまっているようなので、やはり、次の手は1が妥当と思うのですが、いかがでしょうか？おそらく4M尿素存在下でも還元型グルタチオンにより目的のタンパク質を溶出することは可能と推察します。2ではどこかの低濃度尿素では目的のタンパク質は外れ、またそれ以外のタンパク質も外れて来ることになる気がしていますので、そうなると精製の意味がないですよね、、、 書いてて1が正解だろうと達しました。すみません。独り言でした。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.6557-14 - 2018/01/06 (土) 07:32:24 - KY mon様、 Autoinduction mediumは過去トピを見て、気になってはおりました。 実は昨日、可溶化の条件を検討して、リゾチームを加えることで5％ほどは可溶性画分にタンパク質を出すことができました。また、そこからグルタチオンビーズにより精製も可能でした。だいぶ肩の荷が下りた次第です。 Autoinduction mediumはこの機会に勉強することにします。ありがとうございます。 >[Re:8] monさんは書きました : > 封入体を形成しやすいタンパクなので可溶化発現は難しいかもしれませんが、ダメ元でAutoinduction mediumを試してみては。 > Grabski A, Mehler M, Drott D (2005), The Overnight Express Autoinduction System: High-density cell growth and protein expression while you sleep. Nature Methods  2, 233 – 235. > TB培地ベースの処方もネットで見つかります。

(無題) 削除/引用 No.6557-13 - 2018/01/06 (土) 07:23:50 - mon type I membrane proteinの細胞外ドメインなら、浮遊系CHO細胞で分泌させてしまえばよいと思います。セットアップがやや高価となりますが高密度培養用培地が販売されています。条件検討はさほど要らないので0.1~10ug/mL程度を期待するなら早いと思います。接着培養だと総細胞数が少ないので収量は1/3~1/20程度になります。お金持ちなら外注かな。。 C末にSBPタグを付加するのがお薦め。

(無題) 削除/引用 No.6557-12 - 2018/01/06 (土) 01:55:33 - qwせdfrgtじゅぽいうytりうytrds 動物培養細胞は大腸菌のようなかんじに特定の蛋白質を過剰発現することはできないことがおおい（変な蛋白質を不必要につくらないようなシステムが発達してるので、そのようになってるらしい）ので、特定の蛋白質をリコンビナントget目的で使うには適切な材料ではありません。また可溶性画分に来てもhspとかシャペロンがいっぱい結合してることが多くて、目指す蛋白質よりもそっちのほうが多いことも珍しくないです。大腸菌の系ではよくつかわれるGST-tag、His-tag、flag-tagなどで精製しても、大腸菌と違い、非特異的な蛋白質がたくさん混入しアフィニティー精製してもあまり純度があがりません。 虫のはやったことないのでわかりません。

(無題) 削除/引用 No.6557-11 - 2018/01/05 (金) 21:15:07 - 横 封入体に入るのって割とコモンだと聞きますけど、そういう場合のオルタナティブって何ですか？293Tとかですか？ 大腸菌を変えることで結構うまく行ったりするんですかね。

(無題) 削除/引用 No.6557-10 - 2018/01/05 (金) 15:10:17 - おお >本当に結合していたのか確かめた方が良いのでは？ わたしも何処に行ったのか、あるのかという直接的なエビデンスでもって判断したほうがいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.6557-9 - 2018/01/05 (金) 10:23:06 - WInter-8 > 以上のことから、6Mであってもグルタチオンビーズに結合していたのだと思いますが、洗浄の操作で一気に尿素をゼロにしたことで、ビーズから離れてしまったのではないかと考えています。。 > 本当に結合していたのか確かめた方が良いのでは？ 一連の質問ですが、最近はマイクロスケールの透析カセットもあるので、希釈法も透析法も小さいスケールで試すことができます。いろいろやってみたらいいんじゃないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.6557-8 - 2018/01/05 (金) 06:51:42 - mon 封入体を形成しやすいタンパクなので可溶化発現は難しいかもしれませんが、ダメ元でAutoinduction mediumを試してみては。 Grabski A, Mehler M, Drott D (2005), The Overnight Express Autoinduction System: High-density cell growth and protein expression while you sleep. Nature Methods  2, 233 – 235. TB培地ベースの処方もネットで見つかります。

(無題) 削除/引用 No.6557-7 - 2018/01/05 (金) 05:18:12 - KY おおさん、ありがとうございます。 実は友人にも同じような質問をしており、彼も、おおさんと同じく、数％可溶性画分に出ているのであれば、それでなんとかする、と言っていました。 実は昨日、封入体を尿素（2Mと6Mで試しました）で封入体をサスペンドさせ、ソニケーションをしたところ、2Mの方で遠心時にペレットが生じました。このペレットはこれで保存しておいて、その上清にグルタチオンビーズを加えたのち、ビーズをPBSで洗浄し（後にこの洗浄が間違った操作だと気付きましたが。）、ビーズをSDSサンプルバッファーとボイルをしたところ、2M、6Mのいずれにおいても目的のタンパク質は認められませんでした。 また、ビーズの上清もアンバウンドなフラクションとして残しておいたのですが、2M、6Mのサンプルいずれの上清においても目的のタンパク質は認められませんでした。 以上のことから、6Mであってもグルタチオンビーズに結合していたのだと思いますが、洗浄の操作で一気に尿素をゼロにしたことで、ビーズから離れてしまったのではないかと考えています。。 一方、2Mで可溶化した際の遠心時のペレットには目的のタンパク質がどっさり認められました。 以上のことから、6Mで封入体を可溶化し、グルタチオンビーズを加え、その後の洗浄は”6M尿素”で洗浄すべきなのかな？と考えています。十分洗浄した後に、カラム内リフォールドを試してみようと思いますが、このような考え方でも大丈夫なのでしょうか？ カラム内リフォールドや、希釈法、透析法についてのおおさんの考え方をおしえてくださり、大変参考になりました。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.6557-6 - 2018/01/05 (金) 05:07:46 - KY あかねさん、ありがとうございます。 ヒスタグですね。変性条件でも精製が可能ですもんね。 私はせいぜい200マイクロgほどあればよいので、もう大腸菌はやめてしまおうかとも考え出しています。

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