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(無題) 削除/引用 No.6624-7 - 2018/02/06 (火) 14:09:50 - ppp >PoP様 reviewerにはもちろん文章ではそのように説明するつもりです。 ですが、なにかしらデータがあったほうがちゃんと検討した感があるので 印象もよくなると思ったからです。 >AA様 共同研究先にreporterマウスがいるそうなので、こちらからCreマウスを送って 交配してもらうことになりました。ですので解決といえば解決なのですが、 今回の論文の肝になるデータのため、多面的に解析して全てが結論と矛盾しない というデータの方がよいと考え実験は続けたいと思います。 それから、Cre抗体ですが、国内メーカーのため、比較的安いIBLのrabbit抗体 （#18771）を試しました。クエン酸による賦活化をすれば染まることが分かりました。 共染色したいD細胞のB,C以外のマーカーが逆に染まらなくなるというオチになり頭を抱えていますが・・・ もし今後Cre抗体が必要になった方のために書いておきます。 内容がずれてしまうのですが、賦活化が必要なものと賦活化がダメなものを 共染色したいときどのようにされていますか？

(無題) 削除/引用 No.6624-6 - 2018/02/02 (金) 15:23:59 - AA CreにIRESで蛍光タンパクの続いているマウスの蛍光で発現を示したら 「過去に発現していた細胞について分からない」 という指摘があり、結局レポーターマウスを使いました。 Creにあまり良い抗体がないことは割りとよく言われますし、 抗体で検出するのはイマイチな発現量でも、組み換えは十分起きます。 やはりレポーターを使うか、プロモーターの特異性を示して納得してもらうしか無いかと思います

私なら 削除/引用 No.6624-5 - 2018/02/02 (金) 14:57:34 - PoP >[Re:3] pppさんは書きました : > Bの内在性発現がD細胞特異的ですよというデータもだしています。 > ただ、真っ向から否定するわけにもいかないので 「 Bの内在性発現がD細胞特異的ですよ」ということを自信持って もっと強調して伝えて、reviewerのいうことを真っ向からというか やんわりと否定することで切り抜ける方を選びますけどね。

(無題) 削除/引用 No.6624-4 - 2018/01/29 (月) 00:22:51 - X 個人的にはCreの免疫染色やウエスタンではいい思い出がありません（ウエスタンで非特異バンドが複数出て、IHCでは使えないと、当時は判断しました）。なので、reporterマウスが準備できればそちらの方が確実なように思いますが、下記のサイトでCre IHCの議論があるようです。参考になるかと思います（ちょっと古いですが）。 https://www.researchgate.net/post/Cre_immuno_doesnt_work_on_free-floating_sections2 ちなみに、そのCreはCreERのような誘導型のものでしょうか？　そうであれば、核移行も合わせて評価する事により、多少の非特異染色が細胞質に出ても何とかなるかもしれません。臓器Aの中でも細胞種Dに特異的な発現を見るという事は、蛍光染色という事になるのでしょうか？ 臓器Aでの分子Bの発現が、厳密に細胞種Dに限定されることが示されていれば、Cre発現データなしで、そのreviewerを説得する事も可能かもしれません。が、一般に、臓器AにおいてD以外の細胞で分子Bの発現が全くない事を証明するのは極めて困難と思われます。相対的にDでの発現が高い事を示すのは比較的容易ですが、「発現がない」ことを示すのは難しいです。D以外の細胞でも分子B/Cが発現しているというreviewerのコメントの根拠について、少し調べてresponse letterの内容に含めた方が良いかもしれません。 あと、どうしてもCreのIHCが困難な場合は、臓器Aから細胞種Dとそれ以外の細胞を分離する方法があれば、分離した細胞サンプルのgenotyping（recombinationのチェック）で代用することも可能かもしれません。

(無題) 削除/引用 No.6624-3 - 2018/01/27 (土) 15:56:43 - ppp >YKさま たしかにそうなのですが、Rosa26-LacZなどのreporterマウスがいないので Creの免染とターゲットの内在性発現とで代用したいと考えています。 実際の状況は以下のような感じです。 臓器Aでは分子B（ターゲット）も分子C（Creドライバー）もD細胞特異的といわれています。Bの全身欠損マウスの臓器Aの異常がC-Cre, Bfl/flマウスでも出たという結果から、D細胞の分子Bが重要であると結論付けたのです。 しかし、reviewerが臓器AではBもCもいろんな細胞に出てるから、あなたの結論は証明できてないのではと言われてしまったのです。 Bの内在性発現がD細胞特異的ですよというデータもだしています。 ただ、reviewerのいうことを真っ向から否定するわけにもいかないので 複数の方法でBの内在性発現データを取りつつ、Creの発現も示せば 納得してくれるのではと考えた次第です。

(無題) 削除/引用 No.6624-2 - 2018/01/27 (土) 02:45:59 - YK LacZ reporterで染色するという手もあります。そちらが一般的では？

anti-Cre recombinase antibody for IHC 削除/引用 No.6624-1 - 2018/01/26 (金) 16:22:19 - ppp 論文のrevisionでCreの特異性についてコメントが来ました。 これまでいろんなpaperで使われてきたCreなのに今さらそんなこと言うのかと 思いましたが・・・ そこでCreの発現をIHCで見ようと思っています。 もちろん、目的以外の細胞でCreが発現している可能性もありますし、 調べた時点でCre陰性でも過去に発現していたらKOされている 可能性が残ることは重々承知していますが、野生型でのターゲット分子の 内在性発現パターンを同時に調べることで、納得してもらおうと思っています。 組織がmouseなので免疫動物がmouse以外のIHCで使えるCre抗体を探しています。 いくつかのcompanyからrabbitのpolyが出ているようですが決めかねております。IHCで実際に使用経験がある方がいらっしゃいましたら教えていただけないでしょうか。

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