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(無題) 削除/引用 No.6633-9 - 2018/02/01 (木) 08:25:24 - おお もしかしたら挿入することにより翻訳開始の効率が極端に下がってしまった可能性はないかなと。

(無題) 削除/引用 No.6633-8 - 2018/01/31 (水) 20:38:00 - mon ウエスタンブロットで発現量を確認したら？ foldingが正常に行かずユビキチン化されてproteasomeで分解されているかも。 この場合はproteasome阻害剤(MG-132等)処理でバンドが検出されます。

(無題) 削除/引用 No.6633-7 - 2018/01/31 (水) 20:34:18 - mon > 細胞内でGFPなどの蛍光タンパクが発現しているときは > 蛍光顕微鏡で励起光を当てたとき、素人が見ても光ってると判断できるくらい光っているのでしょうか。 発現量と局在によるでしょう。 EGFPに局在化シグナルを付加したコンストラクトだと、細胞膜やER、細胞骨格は見えにくいかな（分解されているのかも）。。ミトコンドリアや細胞質、小胞などへの局在は明るい印象。

(無題) 削除/引用 No.6633-6 - 2018/01/31 (水) 16:55:59 - ピスケ みなさんありがとうございます。 インサートのcDNA配列のストップコドンは取り除いていまして インサート+mKO２が融合タンパクとして発現するようにしています。 このcoding領域のシークエンスは合っているのを確認できているのですが 細胞で蛍光が見られないのが不思議です。 細胞内でGFPなどの蛍光タンパクが発現しているときは 蛍光顕微鏡で励起光を当てたとき、素人が見ても光ってると判断できるくらい光っているのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.6633-5 - 2018/01/31 (水) 13:05:43 - mon おおさんの意見に賛成です。 大腸菌で効率よくタンパクが翻訳されるにはATG(or GTG)開始コドンの上流6~12bpにSD配列が必要です。 元の構成は、 UASプロモーター+大腸菌用プロモーター+大腸菌用SD配列+mKO2(ATG-STOP) となっているとすると、 STOPコドンがあるcDNAを挟んでも、大腸菌では「大腸菌用SD配列+mKO2(ATG-STOP)」部分での翻訳(=ピンク色コロニー）は生じるハズ(bicitronic translation)で、 >ピンク色のコロニーもとれますがインサートが入っていませんでした。 の理由は、単に効率が悪くオリジナルのplasmidばかり取れているのでしょう。 Vector断片だけのLigationとコロニー数を比較しましたか？ ただし、そうだとしても ＞Gal4を発現するプラスミドと一緒に細胞に入れても蛍光が見られません。 の原因は不明です。 挿入cDNAにSTOPコドンがあるから（＝mKO2融合タンパクができない）なのかな。。。

(無題) 削除/引用 No.6633-4 - 2018/01/31 (水) 04:43:47 - おお UASプロモータとORFのあいだに大腸菌用のプロモーターを挟んだりしてないでしょうか。マンマルの発現ベクターにもたまにそういうのがあります。

(無題) 削除/引用 No.6633-3 - 2018/01/30 (火) 23:10:21 - ピスケ 書き込みありがとうございます。 インサートを入れる前のmKO2のコンストラクトは大腸菌に入れると発色します。コンストラクトをもらった研究室からも、コンストラクトが上手くできていれば発色すると聞いていますので、UASプロモーターは大腸菌内でも機能すると考えられます。

(無題) 削除/引用 No.6633-2 - 2018/01/30 (火) 19:53:13 - mon 大腸菌の話と細胞の話を分けてください。それぞれのプロモーターはかなり特徴（配列）が異なります。 UASプロモーターが大腸菌内で機能する根拠は何でしょうか？

蛍光タンパクの細胞での発現とコンストラクト作成 削除/引用 No.6633-1 - 2018/01/30 (火) 16:54:50 - ピスケ UASプロモーターの下流に、ある遺伝子とmKO2の配列をつないだコンストラクトを作成しています。 UASプロモーター+mKO2のコンストラクトがあり、その間に、ある遺伝子のcDNA配列をインサートとして挿入しています。上手くいっていれば、ある遺伝子とmKO2の融合タンパクが大腸菌内で発現し、ピンク色のコロニーが得られるはずです。いくつかピンク色のコロニーもとれますが制限酵素処理をしますと、インサートが入っていませんでした。 発色していない白いコロニーからとれたプラスミドは目的通りの配列でした。しかし、Gal4を発現するプラスミドと一緒に細胞に入れても蛍光が見られません。 どのような可能性が考えられるか、どんな実験を行なって原因をつきとめればよいか、お詳しい方がいらっしゃいましたら教えていただきたく思います。 いろしくお願い致します。

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