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(無題) 削除/引用 No.6638-5 - 2018/01/31 (水) 18:30:29 - AP 上で上げたような阻害物質は、PCI extrantion, EtOH pptでは除けないとされている。だからこそみんな苦労して、工夫してんだな。

(無題) 削除/引用 No.6638-4 - 2018/01/31 (水) 18:26:49 - AP 酵母は扱っていないのであなたのほうが専門家だろうけれど、 植物や真菌類はセルロース、キチンなどの多糖類、ポリフェノール、などなどがPCRの阻害作用の強いものが夾雑してくるらしいね。それを回避するための精製法や反応への添加剤なんかが数多く報告されているくらいだから、フェノクロ・エタ沈じゃ工夫がなさすぎるかもね。 簡単な解決は専用のキットを使う。 自力でやるなら、論文を引いていいという方法を試す。 例えば、添加剤でPVAとかPVPなんかはメラニンなどによる阻害を防ぐと言うぞ。 夾雑物に強いロバストな酵素を使うのもいい（例えばKOD FX neo)。そういう製品は酵素が特別というより添付バッファーがミソで、おそらくその手の添加物が入ってんだと思う。 精製法はChelex 100を使う方法が気に入っている。簡単な割にしっかり増える。阻害物質が良く除去できるようだ。

(無題) 削除/引用 No.6638-3 - 2018/01/31 (水) 14:17:54 - おお まあちょっと何が悪いかわかりませんが、たとえばプラスミドとか、ターゲットのPCRフラグメントとか使っても効率が悪いですか？

(無題) 削除/引用 No.6638-2 - 2018/01/31 (水) 11:53:08 - seventh タカラバイオの公開している実験ガイドを一読してみてはどうです。 http://www.takara-bio.co.jp/prt/guide.htm

酵母ゲノム-qPCR 削除/引用 No.6638-1 - 2018/01/31 (水) 07:02:23 - 酵母太郎 いつも勉強させていただいております。 酵母ゲノムをqPCRする実験を行っています。 この時、PCR効率が悪く困っています。Ct値を縦軸、Log2相対濃度を横軸に、様々な濃度のゲノムスタンダードを取ると、傾き-1でPCR効率が100%になると思いますが、今の実験系の場合-0.6程度にしかなりません。様々な濃度域、市販のソフトフェアを使った様々なプライマー設計でトライしていますが、やはり0.3から0.8をさまよっています。何か改善すべき点は考えられるでしょうか？ よろしくお願いします。 *酵母ゲノムの抽出は一般的なビーズ破砕、フェノクロ抽出、エタ沈という流れです。ゲノムが汚いかと思い、精製ゲノムをさらにカラム精製しましたが、改善はありませんでした。

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