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(無題) 削除/引用 No.6649-10 - 2018/02/06 (火) 14:47:58 - 初心者 中年さま　APさま たったこれだけの違いで。。ということも多々あるみたいですね。 まずはシンプルなものでやってみようと思います。 そこで上手くいかなければ、工夫を施していこうと思います。 ありがとうございます。 勉強になりました。

(無題) 削除/引用 No.6649-9 - 2018/02/06 (火) 13:29:03 - AP f1 oriなんか利用することないだろうけど、教養として知っておいてもよかろう。 発現ベクターの場合、クローニングサイトをひとつずらすだけでも発現量が大きく変わったりすることがあります。途中にパリンドロームみたいな配列がいくつも並んでいたりするといかにも発現を妨げそうです。なので、私はクローニングサイトにしてもその他いろいろなガジェットにせよ、なるべくいらない配列が残らないように組み込みます。使う予定はないけれど、もしかしたら役に立つかも、、、、て感じでいろいろくっつけるのは、二兎追うものはなんとやら、になりかねない。

(無題) 削除/引用 No.6649-8 - 2018/02/05 (月) 21:30:27 - 中年 ssDNAを使う予定が特に無いならf1 oriは全く無視して構いません。前世紀の遺物？

(無題) 削除/引用 No.6649-7 - 2018/02/05 (月) 20:24:18 - 初心者 おおさま ありがとうございます。 そうですね。タグが切れるシステムも確認しました。 またホスト側も発現しやすいような工夫したホストが多数販売されているので、多すぎてどれにすればよいのか困惑しております。 でも調べれば調べるほど面白いなと思いますので、うまく選択して活用したいと思います。

(無題) 削除/引用 No.6649-6 - 2018/02/05 (月) 19:36:06 - おお >タグがありすぎるとやはりタンパク質の発現に影響を与えますでしょうか。 タグが切り取れるシステムもいくらかありますよ。 発現に関して言えば物によってはタグにより全体の長さが長くなると不利な場合もあるでしょう。まあ１００kDa超えなければなんとかなるでしょうけど。また、つけておくと可溶画分に来やすくなるようなタグもあります。

(無題) 削除/引用 No.6649-5 - 2018/02/05 (月) 18:37:43 - 初心者 中年さま、APさま ありがとうございます。 一本鎖DNAが得られ、使い道は色々あることは分かりました。 今、例示していただいたような使用は考えておらず、その他に使えそうな用途も思い付かないのであれば、特に必要ないという判断でよいのでしょうか。 f1oriが付いている製品が多いので、付いている方が何か好都合なのかと思ったのですが。 ベクター、ホスト、導入遺伝子の組み合わせはやはりケースバイケースですかね。やってみて試行錯誤しないといけませんかね。

(無題) 削除/引用 No.6649-4 - 2018/02/05 (月) 17:33:09 - AP F因子を持つ宿主というのは、すなわちF線毛を持つということです。 ファージの分泌や感染に必要だからだったと記憶します。

(無題) 削除/引用 No.6649-3 - 2018/02/05 (月) 17:17:33 - AP f1 oriはM13系の繊維状一本鎖DNAファージの起始点です。 M13は自立的に感染、複製フォーム（RF,　大腸菌内で二重鎖プラスミドとしてふるまう）で増殖、子ファージ産生、細胞外分泌のライフサイクルがまわりますが、f1 oriだけでファージゲノムが含まれていないプラスミドベクターはヘルパーファージを感染させることによって、環状一本鎖DNAとなってファージとして外液に分泌されます。 このようにして得た一本鎖DNAは、 ・かつてはサンガー法シークエンスが二重鎖プラスミドでは困難だったため、このかたちで鋳型を準備した。 ・S1 マッピング、RNase protection assay などに使う一本鎖プローブの作成 なんかで、需要がありました。

(無題) 削除/引用 No.6649-2 - 2018/02/05 (月) 15:26:33 - 中年 f1はM13と同じ一本鎖DNAをゲノムとするファージの複製起点で、このプラスミドを持った形質転換体にヘルパーファージを感染させると、プラスミドが環状一本鎖DNAになったものがファージの外被に包まれたものが培養上清に出てきます。これを集めてフェノール抽出などすれば、一本鎖DNA版のプラスミドが手に入ります。使いみちはいろいろです。 タグがいろいろ付いているとタンパク質の発現に影響はありますが、その影響の大小はケース・バイ・ケースでなんとも言えません。また、マイナスの影響とも限らないと思います。精製にどのタグが良いかも、その後の使いみち次第でケース・バイ・ケースです。

ｆ１複製起点の役割 削除/引用 No.6649-1 - 2018/02/05 (月) 12:14:02 - 初心者 初めてタンパク質発現をするにあたり、ベクターの選択で悩んでいます。 何点かご教授お願いします。 novagenのpetベクターを検討中です。 ・f1 originは何のために必要なのでしょうか。？ある利点は？ 説明書には「F因子を持つホスト内で1本鎖DNAの複製が可能」とありますが良くわかりません。具体的な例はありますでしょうか。 ・タグがありすぎるとやはりタンパク質の発現に影響を与えますでしょうか。 精製方法がHistagと決まっているのならば、pet19bのような簡単なベクターの方が良いのかなとも思います。しかし、精製は何種類かを組み合わせる方が良いのであれば数種類ついている方が良いのかなと思います。 また、タンパクの性質によるのかもしれませんが、最も効率の良いタグ精製はどれでしょうか。 宜しくお願いします。

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