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(無題) 削除/引用 No.6706-5 - 2018/02/19 (月) 19:59:24 - PCR初心者 APさん DNaseはTURBO DNaseを使っています。 プライマーの設計はイントロンを挟んでいます。 しかしマウスβactinはそのcDNA全長がゲノムにコピーされていて、配列がほぼ保存されているので、イントロンを挟んでも産物がcDNA由来かgenome由来か区別できないのです。 実際、普通のPCRで電気泳動しても、RT+だろうとRT-だろうとゲノムテンプレートだろうと、目的のサイズの産物が出てきます。 >DNase処理やったら必ずコンタミをゼロにできるなんて思わないこと。 はい、、その通りですね。。。 ルーチンでDNase処理していたので、ふと思い立って酵素のユニットを考慮してみると、明らかにRNA量に対して酵素の量が足りていないようでした。。。 酵素量を増やしてやり直してみます。 お騒がせして申し訳ありません。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.6706-4 - 2018/02/19 (月) 19:11:36 - AP DNase処理やったら必ずコンタミをゼロにできるなんて思わないこと。 DNAのコンタミの程度はサンプルや手によって幅があるだろうし。 DNaseはどういうのを使っているのかな？　ちゃんとMg++とCa++が入った専用バッファー付きのかな？　Ca++が入っていないバッファー系だと少なくともRT-PCRのゲノムコンタミにはちっとも効かない。 いきなりreaal-time PCRしてるのかい？　まずエンドポイントPCR、電気泳動をしてどんな産物が出来ているか確認してからやるべき。特にRT-で増えている産物はなにか？ プライマーの設計はイントロンを挟むようにしているかね？　だったら産物がcDNA由来かgenome由来か区別できるよね。

補足 削除/引用 No.6706-3 - 2018/02/19 (月) 18:47:58 - PCR初心者 調べたところ、マウスゲノムにはβactinのcDNAが挿入されているので、ゲノムDNAのコンタミだとすると増幅産物自体の説明はつきます。 しかし、DNase処理を入念にやっても増幅される点と、 RNAサンプルによって増幅されたりされなかったりする点に納得がいきません。

total RNAテンプレート(ネガコン)でPCR 削除/引用 No.6706-1 - 2018/02/19 (月) 17:55:08 - PCR初心者 現在、リアルタイムPCR用にマウス組織からtotal RNAを抽出し DNase処理、逆転写処理後、SYBR PremixでリアルタイムPCRの実験をしています。 リアルタイムPCRのネガコンに逆転写していないRNAサンプルを使っているのですが そのRNAサンプルからも、なぜかPCR産物（目的のサイズ）が増幅されます。 特に不思議なのは、試した全てのRNAサンプルで増幅されるのではなく、一部のRNAサンプル(規則性なし)で増幅される点です。 ゲノムDNAのコンタミかと思い、DNase処理をやり直したり、DNaseを繰り返し処理しましたが それでも同じ産物が増幅されてしまいます。 試しに他のTaq酵素で増幅しても、同様です。 これは一体どういった現象なのでしょうか。 何が増えていて、どうやって増えていて、サンプル間の違いはなぜなのか教えて頂けると助かります。 なおPCRターゲットはβactinで、増幅長は80bpくらい、サイクル数は40です。 電気泳動の様子的にプライマーダイマーのようなもわっとしたバンドではなく、クッキリとしたバンドが観察されます。

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