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(無題) 削除/引用 No.6724-5 - 2018/02/28 (水) 10:10:06 - タンパク質精製初心者 mon様、なるほど！確かに、おっしゃる通りですね。 今、結果が出ました。結果は0.0625Mアルギニンが残存していてもGST精製効率が著しく悪いようでした。 以下、実験デザインです。 リフォールドバッファー 1 M Arginine, 2 mM EDTA, 10 mM GSH, 0.5 mM GSSG 希釈バッファー 20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl (pH 8) GSTタンパク質 5ug/sample tube GSH-sepharose トータルボリューム1 mlの系で3時間4度ローテーションしながらpull downしました。 リフォールドバッファーを希釈バッファーで希釈する希釈系列を作り、終濃度のアルギニン濃度としては、1M、0.5M、0.25M、0.125M、0.0625M、それから0Mです。 結果はアルギニン濃度0.0625Mでわずかに落ちてきていました。ただこの時、還元型GSHの終濃度は1.56mMほどあるので、もしかしたらそれもグルタチオンビーズに結合しなかった原因と思われます。

(無題) 削除/引用 No.6724-4 - 2018/02/28 (水) 09:38:23 - mon > それにしても、リフォールド後にグルタチオンセファロースでGST精製するのはお決まりの道かと思っていましたので、 GSTはそもそも可溶性発現用のタグなので、封入体を想定していないし。

(無題) 削除/引用 No.6724-3 - 2018/02/28 (水) 07:28:30 - タンパク質精製初心者 おお様ありがとうございます！ そうですね。今標品のGSTを使って、アルギニンを含むリフォールドバッファーとトリスバッファーの比率を変えて、グルタチオンセファロースへのエッペンチューブのスケールでの結合を確認しているところです。 結果がわかり次第、あげさせてもらいますね。やはりやってみないとわからないこともありますもんね。。 それにしても、リフォールド後にグルタチオンセファロースでGST精製するのはお決まりの道かと思っていましたので、コンパティブリティの表が出て来ないことに少し驚きました！

(無題) 削除/引用 No.6724-2 - 2018/02/28 (水) 06:48:51 - おお もちろん情報をしっかり集めて判断するのはいいことだと思います。ただやってみるというのも科学的手法としてはあるわけで（もし理論があったとしても理論通りかということもありますし）、少量で試してみる手はあるかもしれません。

1Mアルギニン含有リフォールド液から直接GST精製できますか 削除/引用 No.6724-1 - 2018/02/27 (火) 08:04:35 - タンパク質精製初心者 質問させてください。 今、6Mで可溶化した封入体タンパク質（GSTーXーHis6）を10倍希釈した、1Mアルギニンを含むリフォールド溶液（0.6M グアニジンHCl、酸化型および還元型グルタチオン、150mM トリス、2mM EDTA）があります。 これをアミコンのフィルターチューブでバッファー交換をしようと思ったのですが、フィルターが詰まってしまい、たった50mlの溶液をバッファー交換するのに約1日かかるほどでした。遠心前には目に見える浮遊物はないので、遠心中に析出しているのだと思います。 今は、透析をすることでバッファー交換をしようとしていますが、それと並行して、もしかしたら1Mアルギニンを含むリフォールド溶液でもGST精製できるのではないか？と考えました。 ニッケルセファロースはアルギニンとの相性が悪いことは説明書で見つけましたが、グルタチオンセファロースの方ではアルギニンとのコンパティビリティが書かれてありませんでしたので、どうなのか気になっています。もし問題なければ、透析すら不必要になりますので、ロスが減るのではないかと期待しています。 いかがでしょうか？ ちなみに文献にはアルギニンの濃度を希釈していって、どの濃度であればニッケルビーズがワークするかというのを検討している論文を見つけましたが、それによると、200mMのアルギニンであれば問題なくニッケルビーズがワークするみたいでした。

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