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(無題) 削除/引用 No.6728-12 - 2018/03/01 (木) 22:16:52 - りょう 皆様、 様々な貴重なご意見ありがとうございます！ おおさん、 ヘパリンは試していませんが、精製にヘパリンカラムを使ったことがありますので、強固に結合すると思われます。最終産物中には含めませんが、精製途中では有用かもしれません。 monさん、 脂肪酸は今まで試してみたことはないです。取り扱いが容易なようでしたら試してみる価値はあるかと思います。ph5あたりのbufferは今まで使っていませんでしたが、検討してみます。 qqさん、 情報ありがとうございます。検索してみます。 くぁswろp；＠さん、 実験上、かなりの収量が必要になり、さらに高濃度にできないためゲルろ過は難しいと判断していました。以前、高濃度のサンプル液を単純に0Mの溶液と混ぜたら1時間以内に液が白濁してしまいました。 totoさん、 動物実験をする人から塩濃度は抑えてほしいと要望があり、PBSにしていましたが、一度話し合ってみます。

(無題) 削除/引用 No.6728-11 - 2018/03/01 (木) 18:47:44 - toto 1M NaClで溶けるのなら、その状態で濃縮して凍結なり何なりで保存しておけばいいのでは？たまにそういう蛋白もあります。動物や細胞培地に加えるときは浸透圧が影響ないくらいに希釈されるでしょうし。

(無題) 削除/引用 No.6728-10 - 2018/03/01 (木) 17:44:37 - くぁswろp；＠ ヒストンなど強塩基性蛋白質は普通の蛋白質と逆で酸性溶液（というか塩酸とか硫酸）には高い溶解度を示すものが多く、実際そうやって、多くのきょう雑蛋白質を沈殿させて、上清に目的のものを分画して精製したりする。pH2~4くらいのbufferで試してみたらどうか。 沈殿が生じるまでにある程度時間がかかるならば、時間かかる透析はやめて、希釈あるいはゲル濾過（脱塩カラム）により速攻でbuffer交換し、すみやかに動物に投与、あるいは培地に添加すればよい。

(無題) 削除/引用 No.6728-9 - 2018/03/01 (木) 14:13:55 - mon pH5~6程度でも沈殿するのでしょうか。この辺ならタンパクも変性しないし、動物投与も可能ですが。

(無題) 削除/引用 No.6728-8 - 2018/03/01 (木) 13:31:33 - qq BRENDAからあなたが精製しようとしている酵素もしくはその類縁酵素を探して、Molecular Propertiesの****stabilityを見てみると良い解決方法が既に知られているかもしれない。 例えば、リゾチームだと分泌シグナルがアグリゲーションを促進している場合もあるそうです。

(無題) 削除/引用 No.6728-7 - 2018/03/01 (木) 10:48:52 - mon 電荷なら、ポリリン酸かスペルミンのようなポリアミン、はたまたオレイン酸のような脂肪酸で安定化しないかな。

(無題) 削除/引用 No.6728-6 - 2018/03/01 (木) 01:24:53 - おお >なにか電荷を持って影響が少なそうなものがいいのかな。 ヘパリンとかだめかな

(無題) 削除/引用 No.6728-5 - 2018/03/01 (木) 01:18:56 - おお >1）NaClを1M加えると沈殿はなくなる。 これから思うにイオン相互作用が関与していそうに思えます。塩濃度を上げることでイオン相互作用を切ることができますので。どうだろう、なにか電荷を持って影響が少なそうなものがいいのかな。

(無題) 削除/引用 No.6728-4 - 2018/03/01 (木) 00:57:25 - りょう APさん、 早速ご意見ありがとうございます。 確かにそうだと思います。 いったん沈殿を起こすと、そのあと高濃度の塩で溶解しても、電気泳動でスメアーなバンドがみとめられますので、フォールディングがおかしくなっている可能性も考えています。 monさん、 以前に0.5M Trisにしたら確かに沈殿は抑えられました。 このタンパクは後々に動物実験と細胞実験に使いたいため、PBSに置換する予定で、なかなか塩濃度を上げることができませんが、透析のたびに大変沈殿します。 現在いくつかのものを加えていますが、（マルトースとか）、なかなかうまくいっていません。

(無題) 削除/引用 No.6728-3 - 2018/02/28 (水) 22:12:52 - mon 使用目的によりますが、0.1M HEPES-NaOH(pH7~8)とか、0.1M Na-PO4(pH7~8)、0.15M Na-Citrateに置換するとか。Tris濃度を0.1M程度にあげるとか。

(無題) 削除/引用 No.6728-2 - 2018/02/28 (水) 20:10:48 - AP まあタンパク質は一般に大きな分子で、分子全体の総和チャージだけでなくドメインごとのチャージで相互作用しえるので、そういうこともあり得るかな、と。

等電点の高いタンパク質の精製 削除/引用 No.6728-1 - 2018/02/28 (水) 19:51:36 - りょう 今、等電点がおよそ9あるタンパク質を発現後精製していますが、沈殿して困っています。 発現後、イオンカラムにかけて溶出後、tris, ph7.5, 150mM NaClで透析しましたら、翌日に明らかな沈殿ができています。 この時点で精製度は90％以上です。 念のため、沈殿を遠心で集めてゲルに流すとそのものであることが分かりました。 いろいろと試して分かったことは次のことです。 1）NaClを1M加えると沈殿はなくなる。 2）タンパク質濃度が0.5mg/mlを超えると沈殿を起こす 3）pHを上げると沈殿する 4）アルギニンを加えてもあまり効果が見られない 等電点が高いので、ph7.5あたりでは常にプラスにチャージされていて溶解され安いと思っていたのですが、なぜ中性あたりで沈殿されるのかがよくわかりません。 タンパク質がチャージされているので、反発しそうな気がするのですが。 もしなにか思いつくことがありましたら教えてください。

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