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(無題) 削除/引用 No.6742-20 - 2018/03/09 (金) 11:00:57 - おお >[Re:19] 小言幸兵衛さんは書きました : > このようなものが。 > > http://www.j-tokkyo.com/2006/G01N/JP2006-126166.shtml あ、PEGつかってますね。一次抗体と２次抗体で塩濃度を変えているようですし。

(無題) 削除/引用 No.6742-19 - 2018/03/08 (木) 16:21:32 - 小言幸兵衛 このようなものが。 http://www.j-tokkyo.com/2006/G01N/JP2006-126166.shtml

(無題) 削除/引用 No.6742-18 - 2018/03/08 (木) 13:54:39 - miw おお様、まっくろん様、 熱変性について、様々な具体的なアドバイスありがとうございます。 早速いくつか試してみて、また結果をご報告できればと思います。

(無題) 削除/引用 No.6742-17 - 2018/03/08 (木) 13:26:48 - まっくろん 　熱変性による凝集を疑うようであれば，おおさんがおっしゃるように低い温度での処理を試されてはどうかと思います。当方であるタンパク質（膜タンパクでした）を検出していた際，95℃で上手くいかないことが度々あったため，60℃15分（こちらの掲示板で見て試しました）に変更したら，上手くいった経験があります。参考になれば幸いです。 　また一応確認ですが，データシートにIPと免染が載っているということですが．ウエスタン（変性させたタンパク質の検出）は[使用可]となっているのでしょうか？もし変性させると検出できないようであれば，未変性で検出する方法を検討するのもいいかと思います。

(無題) 削除/引用 No.6742-16 - 2018/03/07 (水) 22:29:45 - おお >[Re:15] miwさんは書きました : > ちなみに、私の目的のタンパクのサイズは70ｋDaなのですが、250ｋDaに一番濃いバンドが出ます。 > これはタンパクの変性が足りないということはあるのでしょうか？ > β-メルカプトエタノールとSDSを用いて、95℃で5分の加熱処理をしていますが、他の方法を試した方が良いのでしょうか？ > 教えていただけますと幸いです。 逆かもしれない。熱変性によるアグリゲーション。 加熱を行わないかより低い温度で編成するとか、変性後ウレアを入れるとかいくらか解決方法がある。 膜タンパクにそういうことが起こることがたまにある。

(無題) 削除/引用 No.6742-15 - 2018/03/07 (水) 21:18:17 - miw ちなみに、私の目的のタンパクのサイズは70ｋDaなのですが、250ｋDaに一番濃いバンドが出ます。 これはタンパクの変性が足りないということはあるのでしょうか？ β-メルカプトエタノールとSDSを用いて、95℃で5分の加熱処理をしていますが、他の方法を試した方が良いのでしょうか？ 教えていただけますと幸いです。

(無題) 削除/引用 No.6742-14 - 2018/03/07 (水) 01:04:17 - ぽじもん >[Re:10] miwさんは書きました : > ぽじもん様、 > > WTのマウス大脳で発現量は多くはないものの、ポジティブに出るはずですのでポジコンのつもりで置いたのですが、そういうことではないのですよね？ そうです、ポジティブに出るはずのサンプルを、ということです。すでにあるのですね。それでもどのバンドかわからないようでしたら、ほかにすでに論文などで報告されているサンプルとかないですかね。身近な先輩たちは同じ実験の経験はないのでしょうか。 > > ポジモン様のおっしゃるポジコンというのは、例えば、細胞に目的遺伝子をトランスフェクションしたものとか、そういったものでしょうか？ > もちろんそれも用意できるのならばいいと思いますが、当方がイメージしたのは上のほうです。そちらのほうが簡単に用意できるかな、と思ったしだいです。

(無題) 削除/引用 No.6742-13 - 2018/03/06 (火) 17:53:48 - TS 本筋からそれますが、たしかにPVPとかのポリマー系が本体かもしれませんね。 ただ、WB用は1次抗体、二次抗体用の溶液がありますし、 IF用は、2パターンの溶液が用意されていますね。 多少のの工夫はされているのかなぁと思います。 IF用は、AとBとなっていますが、 確かに免疫反応の程度がそれぞれ違う気がします。 Aでうまくいったり、Bでうまくいったりする。

(無題) 削除/引用 No.6742-12 - 2018/03/06 (火) 17:45:56 - 774R >そのバンドが特異的なものであるかどうか判断されておられるのでしょうか。 株化細胞なら様々な操作ができますが、組織サンプルだと非常に難しい問題ですね。 ノックアウト個体が使えれば一番だと思いますが、入手できない場合は様々な方法を組み合わせて結論するしかないのだと思います。 ・エピトープの異なる複数の抗体でバンドの位置が一致するか。 ・ある抗体でIPをして別の抗体でWBする。 ・薬物等で発現量を変化させたとき予想道理の挙動をするか。 ・バンドの位置に相当するゲルを切り出して質量分析に掛ける。 ほかにもまだあると思いますが、すぐに思いつくのはこれくらいです。

(無題) 削除/引用 No.6742-11 - 2018/03/06 (火) 14:23:56 - おお >[Re:7] PYKさんは書きました : > 何か1-2年くらい前に、ネットでCan Get Signalの組成を見たような気がする。普通のBuffer（TBSだかPBS）ベースにPEG6000か何かを入れてあっただけだった気がするが、確信がない。 > PVPかも

(無題) 削除/引用 No.6742-10 - 2018/03/06 (火) 14:16:16 - miw ぽじもん様、 WTのマウス大脳で発現量は多くはないものの、ポジティブに出るはずですのでポジコンのつもりで置いたのですが、そういうことではないのですよね？ ポジモン様のおっしゃるポジコンというのは、例えば、細胞に目的遺伝子をトランスフェクションしたものとか、そういったものでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.6742-9 - 2018/03/06 (火) 14:08:10 - miw お返事頂きました皆様、ありがとうございます。 抗体のデータシートにIPの画像があり、また実際に免染ですときれいに染まっているため、抗体の特異性はあるのだろうと考えていました。 しかし自分のウエスタンの目的位置にあるバンドが特異的なものであるということではないと思いますが・・・ ちなみに皆さんはいつもどのようにそのバンドが特異的なものであるかどうか判断されておられるのでしょうか。もしよろしければお聞かせください。 Can Get Signal のサンプル、良いですね。早速問い合わせしてみます。

(無題) 削除/引用 No.6742-7 - 2018/03/06 (火) 11:30:43 - PYK 何か1-2年くらい前に、ネットでCan Get Signalの組成を見たような気がする。普通のBuffer（TBSだかPBS）ベースにPEG6000か何かを入れてあっただけだった気がするが、確信がない。

(無題) 削除/引用 No.6742-6 - 2018/03/06 (火) 09:43:37 - TS Can getの原理はよくわからないけど、 WBや組織染色でいまいちうまくいかない抗体が きれいにワークしたりします。 意外と試す価値はあるものです。 まったく見えないバンドやシグナルが見えるようになることは少ない気がしますが、薄いシグナルが明確になることはまぁまぁあります。 ゲトさんもおっしゃってますが、試供品をもらえますよ。数回はできるはず。

(無題) 削除/引用 No.6742-5 - 2018/03/06 (火) 08:57:13 - ゲト can get signal いいですよ。 半信半疑で試してみましたが、大抵の抗体はシグナルが強くなります。抗体によってはバックもあがる場合はありますが、スキンミルクよりもバンドがよく見えます。 特異性はスキンミルクとくらべて　変わらないような、良くなるような。少なくとも使って損はないと思います。 とりあえず、試供品とかもらえると思うので、試してみては。

(無題) 削除/引用 No.6742-4 - 2018/03/06 (火) 05:01:23 - ぽじもん 今ご使用の抗体がきちんと目的たんぱく質にワークしているのかどうかを確認したいのですね？検出薬を変えるのも一つの手だとは思いますが、何かポジティブコントロールになりそうなサンプルはないでしょうか？それをご自分のサンプルと一緒に流して検出すると目的の位置がわからないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.6742-3 - 2018/03/06 (火) 02:52:46 - おお まずは特異性を確認する、特異的なバンドを確認するのが先ではないでしょうか？ Can get signal はバックグランドを低減する試薬だったと思いますが、実際何が入っているとかメカニズムとか興味がありますが、それがわかれば少し考える材料は増えるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.6742-2 - 2018/03/06 (火) 01:22:30 - ふと 抗体が認識する抗原をここで明らかにできませんか？ アドバイスできるかもしれません。

Can get signal 削除/引用 No.6742-1 - 2018/03/06 (火) 01:12:46 - miw ウエスタンを始めたばかりの者です。 現在、脳の神経細胞に発現しているあるタンパクをウエスタンを用いて比較したいと思っています。 市販の抗体がそれほどなく、今使っている抗体をワークさせることができたらと思っています。 （残りの抗体はラボの他の方が既にワークしないと言っているため、それらは後回しにしています） 目的の位置にはバンドがうっすら見え、他の位置に濃いバンドが一本、その他薄いバンドがいくつかあります。全部が非特異的なバンドなのかもしれません。 そこでTOYOBO Can get signal を試してみようかと思っていますが、すぐには買ってもらえそうにはありません。できれば、使用された方の感想をいただけないかと思いトピックを立てさせて頂きました。 今試したのは転写の時間の調節、抗体濃度を変えたことくらいです。5%スキムミルクで固定しています。 よろしくお願いいたします。 勿論他のおすすめの方法、試薬などがありましたら教えていただけますと非常に助かります。

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