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(無題) 削除/引用 No.6770-9 - 2018/03/19 (月) 20:20:20 - mon 遺伝子合成は\40-60/bp（基本ベクターへクローン化・配列確認済み）です。 発現ベクターへのクローン化は\0~\9000のようです。 各社で見積を取れば良いでしょう。 クローン化しないで遺伝子断片(PCR産物？：配列未確認）なら半額程度です。

(無題) 削除/引用 No.6770-8 - 2018/03/19 (月) 16:49:56 - おお >ゲノムで13kb、cDNAで1400bpくらいです。変異の場所はわかっています。 ではその変異によってその変異の箇所のアミノ酸がかわったりフレームがかわってトランケーションがおこることが示されていますか？それともmRNAのエクソンなどの構成が変わって変異箇所以外に影響を及ぼしたり、場合によっては蛋白が発現しない（NMDなどふくめて）などの可能性は否定できますか？ もし上記のことが不明確であるならゲノム上で１３kbならゲノムをPCRしてイントロンも含めた状態で（エクソンを切り貼りせず）その部分を発現ベクターに組み込めばどうですか？組織特異的選択的スプライシングがある場合とかは入れる細胞によっては注意しないといけないかもしれません。また、大腸菌は使えませんけど。 変異が変異箇所のアミノ酸配列に影響を与えるというのがわかっているなら正常と思われるcDNAを買うか、発現している細胞からとってきてSite direct mutagenesisで変異体を作ってもいいのではとも思いますがどうでしょうか？ もちろんゲノムをいれた発現ベクターを細胞で発現させれば、そこからcDNAはとれますけどWtのcDNAを組み込んだベクターが手に入るならそこまで通り道しなくてもいいようにも思えます。

(無題) 削除/引用 No.6770-7 - 2018/03/19 (月) 15:45:46 - 小児科医師（ゆとり教育） ご返信遅くなり申し訳ありません。 >おおさん ゲノムで13kb、cDNAで1400bpくらいです。変異の場所はわかっています。 >TK-1さん、monさん なるほど、合成してしまうという手もあるのですね。発現ベクターへのクローニングサービスも非常に興味があります。1400bpくらいのDNAを合成するといくらくらいかかりますか？

(無題) 削除/引用 No.6770-6 - 2018/03/15 (木) 11:50:57 - mon 組換えタンパクを作製するためにcDNA(CDS)をクローン化するだけなら、TK-1さんに同意で遺伝子合成を依頼した方が材料の入手が難しいなら安上がりで早いかも。PCRの成功率は100%ではありませんし、配列を確認する手間もあります。 遺伝子合成なら、制限酵素部位の導入・削除やコドン最適化も可能ですし、(タグ付き）発現ベクターへのクローニングサービスもあります。Mutantも同時に依頼すると安価になるサービスもありますよ。

(無題) 削除/引用 No.6770-5 - 2018/03/15 (木) 04:46:41 - おお 変異の場所はわかってないのですよね。。。

(無題) 削除/引用 No.6770-4 - 2018/03/15 (木) 04:45:33 - おお その遺伝子ゲノムでどれ位の大きさですか？

(無題) 削除/引用 No.6770-3 - 2018/03/15 (木) 01:37:58 - TK-1 gene synthesis.

血液での発現が少ないRNAの回収法 削除/引用 No.6770-1 - 2018/03/14 (水) 22:33:44 - 小児科医師（ゆとり教育） いつも大変お世話になっております。 ある遺伝子Xから作られる蛋白に興味があり、正常な遺伝子Xから作られる蛋白と変異を持つ遺伝子Xから作られる蛋白を比較したいと考えています。大まかにですが、mRNAからcDNAを合成して細胞（培養系細胞？大腸菌？）に導入し、蛋白質を抽出して比較するという実験計画を検討しています。正常では4量体を形成している蛋白なのですが、変異が入ると4量体を形成できないのではないかと推測しています。 対象はヒトですが、容易に検体が取れる組織ではないため、組織検体からmRNAや蛋白を回収することはできません。採取可能な検体は、血液かせいぜい皮膚生検なのですが、NIBI geneによれば肺、前立腺、精巣で発現が高いと記載されています。このような場合、どのようにmRNAを回収すればよいでしょうか？ エクソンは3つで、エクソン1の中ほどに開始コドンがあり、エクソン3の200塩基くらいのところで終始コドンがあります。蛋白は約500アミノ酸から成り立っています。血液でも少しはmRNAが作られていると仮定し、血液からのmRNAの回収を試してみるべきでしょうか？もしくはmRNAを回収するのではなく、genomic DNAを切り貼りしてcDNAを自分で作ったほうが良いでしょうか？ お手数をおかけしますが、上記につきましてご教授賜りますと幸いです。

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