BioTechnicalフォーラム [SDS PAGEのReducing Agent:二量体を単量体にしたい]

SDS PAGEのReducing Agent:二量体を単量体にしたい

No.6783-TOPIC - 2018/03/21 (水) 06:36:02 - 困ってます

SDS-PAGEからのWBでタンパクを検出しています。自分が研究しているタンパクはホモ二量体を形成することが知られています。

細胞をRIPAで溶かしたものを、Sample Buffer （InvitrogenのNuPAGEシステムを使っていて、Sample Bufferに入っているのはSDSではなくて正しくはLDSになるようです）と、キットが推奨するReducing Agentではなくて2-MEと混ぜて70Cで10分処理したものをゲルに流しています。

WBで目的のタンパクの単量体、60kDaのバンドが検出できるのですが、同時に、二量体と思われる120kDaのバンドも見られます。発現ベクターで発現させた場合に、両方のバンドが強く出るので間違いないと思います。

これではタンパクの発現量の比較に使えないと思い、なんとかこの二量体と思われるバンドを単量体にしようとしています。

単純に2-MEの量を増やしてみましたが（10ugのタンパクで全量が25ulに対して14.3Mの2-ME原液をを1ul使っていたものを、1.5ul、2ulと増やしてみた）効果はありませんでした。

SS結合を切るために、別の操作が必要になることがあるのでしょうか？

キット推奨のReducing AgentはDTTが使われているのですが、2-MEでは切れないものがDTTでは切れる、ということはあるのでしょうか？

参考論文では、ゲル全体が見れないので120KDaのバンドが出ているのかどうかわかりません。その論文では2-MEを使っていました。

どうかよろしくお願いします。
　

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No.6783-5 - 2018/03/22 (木) 09:11:10 - toto

>というのは、タンパクのdenatureが足りないのでS-Sが露出せずreducing agentが作用できない状態、という解釈でよろしいのでしょうか？

ということもありえますし、S-Sが切れてはいても、全体的な立体構造がSDS耐性なのかもしれません。前者の場合は、2MEのほうがDTTよりも小さいので、まれに2MEのほうがDTTよりも有効なこともあります。

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No.6783-4 - 2018/03/22 (木) 01:08:58 - 困ってます

おお様、toto様ありがとうございます。

>DTTのほうが多分還元に関しては強いと勝手に思ってますので試す価値はあると思います。

そう高いものでも無いので、DTT入りのReducing Agentを買って試してみようと思います。

>あぐったり
これを避けるために低い温度で調整（70Cではなくて室温で1時間とか）することを試そうと考えていましたが、

>70度で加熱ではなく、95度処理～煮沸すると効果ある場合があります

というご意見も頂いたので、両方試してみようと思います。

toto様がおっしゃる
>S-Sが残っているというよりは、おそらくフォールディング
というのは、タンパクのdenatureが足りないのでS-Sが露出せずreducing agentが作用できない状態、という解釈でよろしいのでしょうか？

>目的が定量だけでRIPAでとかす必要がなければ、細胞を直接SDSバッファーで溶かした方が簡単です

別ラボで別タンパクを研究していた頃は、RIPAを使わずSDS lysis Bufferを直接細胞に振りかけていました。これも試してみようと思います。当時使っていたそのlysis BufferのSDS濃度はBCA assay kitの説明書によると測定を妨げないレベルだったので、そのままタンパク定量をしていました（Standardもlysis Bufferで希釈したりしてみましたが、問題ありませんでした）。

ありがとうございました。

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No.6783-3 - 2018/03/21 (水) 19:56:26 - toto

S-Sが残っているというよりは、おそらくフォールディングが残っているからなので、70度で加熱ではなく、95度処理～煮沸すると効果ある場合があります。あとは、RIPAに入ってるNP40/DOCがSDSの変性作用を弱めるので、これらSDS以外の界面活性剤の最終濃度をできるだけ低くするか、あるいは、目的が定量だけでRIPAでとかす必要がなければ、細胞を直接SDSバッファーで溶かした方が簡単です。

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No.6783-2 - 2018/03/21 (水) 12:37:42 - おお

あぐったり、酸化などの影響でクロスリンクされてたりしてませんか？
DTTのほうが多分還元に関しては強いと勝手に思ってますので試す価値はあると思います。まあそれでもだめなら変性後にウレアを加えて見てもいいかもしれません。

SDS PAGEのReducing Agent:二量体を単量体にしたい

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No.6783-1 - 2018/03/21 (水) 06:36:02 - 困ってます

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