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(無題) 削除/引用 No.6790-7 - 2018/03/26 (月) 09:41:35 - AB このキットの原理を知らないのでトンチンカンかもしれないけど Avidin/Biotin Blocking Kit 　https://vectorlabs.com/avidin-biotin-blocking-kit.html

(無題) 削除/引用 No.6790-6 - 2018/03/24 (土) 08:05:36 - AP >Click-itケミストリーを施していないサンプルでも強く出ており、S/N比が低く困っております。 内在性のビオチン化タンパク質ならブロックのしようがない。 ビオチン以外の標識に変えるのが近道かも。

(無題) 削除/引用 No.6790-5 - 2018/03/24 (土) 07:34:29 - P 同僚がその実験系で２年潰しました。 ストレプト、、、の実験系はバックが高い。 １％BSAはblockingとしてどうでしょうか？ もっと上げたほうが良いのでは、、、 （物にもよると思いますが、2% skim milkでもバック相当ありました）

(無題) 削除/引用 No.6790-4 - 2018/03/24 (土) 06:08:34 - qうぇdrf 細胞内にはもともとbiotin化修飾蛋白質はわりとあるから、biotin化処理しないサンプルでもアビジン-HRPと反応するのはそれはしょうがない。biotin標識するまえにmonomeric avidin(無標識のもの）と反応させて、内在性biotinをまずblockしてから,キットでbiotin化処理を行い、そのあとavidin-HRPと反応させてみたらたぶん改善する気がする。

(無題) 削除/引用 No.6790-3 - 2018/03/23 (金) 10:15:04 - AP BSA (fraction V)にもいろいろな精製度のものがありますから、同じBSAだからといって、文献にあるBSAとあなたの使っているBSAは同等ではないかもしれません。ビオチンをかなり含んでいる製品かも。ミルクと違ってビオチンはメジャーな不純物ではないかもしれませんが、わざわざbiotin-freeをうたっている製品もあるくらいですから可能性は否定できません。 それと1%は薄いかも。多くのプロトコールでは3%が相場ではないでしょうか。 ゼラチンや非生物由来のブロッキング剤はいかが

(無題) 削除/引用 No.6790-2 - 2018/03/23 (金) 09:40:00 - mon BKが高い場合の対処法として一般的な手法は試してみましたか？ ブロッキング剤はこの場合選択肢が少ないので変える（混ぜる）のは難しいですね。PVPを加えるとか？ HRPストレプトアビジンを4000倍希釈＞さらに5倍〜50倍希釈 （これが有効な気がします。。。） 希釈液にもTween20＋0.1%BSAを添加する Tween20ではなく、0.1% TritonX100 を洗浄液に加える

HRPストレプトアビジンの高いバックグラウンド 削除/引用 No.6790-1 - 2018/03/23 (金) 07:23:32 - M2 いつも拝見させていただいております。 今、Click-itケミストリーで細胞内タンパク質をビオチン化したのち、PVDF膜をHRPストレプトアビジンでブロットしているのですが、HRPストレプトアビジンによるバックグラウンドが非常に高いです。 ブロッキングは1％ BSA in TBS-Tでオーバーナイト、4度しており、その後、同じ組成のバッファでHRPストレプトアビジンを4000倍に希釈し、室温30分インキュベートしています。 Click-itケミストリーを施していないサンプルでも強く出ており、S/N比が低く困っております。 洗浄は十分に、TBS-Tで行なっております。 よくマウス組織ライセートの糖鎖を見る際、ビオチン標識レクチンを用い、レクチンブロットを行います。その時にも同じHRPストレプトアビジンを用いていますが、こういった際、組織中のビオチンをマスクするためのキットでレクチンを当てる前にブロッキングしており、いい感じなのですが、今回の私のケースだとサンプル内のビオチン修飾を見たいので、上記キットは使用できません。 何か良い方法はありませんでしょうか？ ネイチャープロトコルには5％BSAをブロッキングに使われていましたが、非常に高価なので1％でやっていますが、これが原因でしょうか？ よろしくおねがいいたします。

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