BioTechnicalフォーラム [LB/Amp培地→2xYTでの継代ができない]

LB/Amp培地→2xYTでの継代ができない

No.6802-TOPIC - 2018/04/01 (日) 20:25:46 - ひつじ

PCR産物のTAクローニングを行っています。

LB/Amp培地にはXgalをスプレッドしており、ブルーホワイト選別して2xYT液体培地に継代オーバーナイト培養する際に、菌が増殖するのが20本中1本という状況で、非常に効率が悪いです。
はじめは2xYTが問題かと思い、調整し直しましたが状況は変わりません。
Xgalの問題も考えましたが、青色を呈するコロニーもあることから、問題ないように思われます。
液体培地で増えたわずかなサンプルについては、ミニプレップ、制限酵素処理で、半数程度に目的産物が入っていることが確認できました。

目的としては、数本でもPCR産物の配列が読めれば良いのですが、あまりに効率が悪いので、解決したいと思っています。

皆様、問題点をご指摘・ご教示いただけますでしょうか。
　

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No.6802-14 - 2018/04/18 (水) 12:40:34 - ひつじ

皆様

多々ご教示いただきありがとうござました。
もとのLB/Ampプレートのアンピシリン失活でネガティブコロニーが増えてしまった、という考えに傾いており、目的配列のクローニングをシーケンスで確認できたため実験はひとまず終了しています。

プレートを作り直して同一プロトコルにて再実験して検証すべきとは思いますが、このトピックは、解決とさせていただきます。

ありがとうござました。

(無題)

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No.6802-13 - 2018/04/05 (木) 20:59:43 - AP

これがmost likelyだな。
>・プレートのアンピシリンは、確かにへたっているかもしれません。これまで作って１ヶ月はもつようだったので１ヶ月ぎりぎりのプレートを使いましたが、ご指摘のようにアンピシリン失活が原因だったのかもしれません。

非形質転換体もあるていどコロニーを形成していたんでしょう。

経験上、Ampは勘違いで十倍量（500 ug/mL)入れいれてしまってもちゃんと増えるので、液培のときの濃度間違いのセンはないんじゃないかな。

(無題)

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No.6802-12 - 2018/04/05 (木) 18:18:45 - ひつじ

～様
失礼しました。
培養温度でしたら３７度で、毎回温度計で計っています。温度計が壊れていなければ、毎回一定だとは思います。

ロットとは市販培地を使用したときのことかと、早とちりしてしまいました。おっしゃるようにプラスミド、コンピテントセル、培地等の「種類」は同じ、という程度の意味でしかありません。

抗生物質のストックは、これまでポジティブだったものと同じもの（から分注したもの）を使っているので、少なくとも濃度については同じでしょう。
冷凍庫の管理等については、要因を排除する情報は「適切に管理するようにしている」という程度のことしかお示しできません。

(無題)

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No.6802-11 - 2018/04/05 (木) 18:04:11 - ~

・「温度」は何の温度をさすのでしょうか
→培養温度のつもりでしたが、他の操作（反応温度等）の時点での温度も確認した方がいいでしょう。
インキュベーターやウォーターバスの表示が壊れて温度が低いor高い状態なら、菌の増殖が悪くなり貴方が増えていないと判断するかもしれません。

・培地、抗生物質濃度、プラスミドは、これまで毎回（上手くいくいかない問わず）同じ組み合わせです。pCRII-TOPOベクターをTOP10コンピテントセルに、LB/Ampプレートから２xYT液体培地です。
少なくとも培地は作り直したと書いていますのでロットが違いますよね。
貴方はそれを同じと言ってますので、他についても貴方が同じと読んでいるものは別のものかもしれません。となると、貴方が同じと言っているもの全てが怪しいです。

抗生物質のストックの濃度が間違っていれば菌が増えないかもしれません。
ベクターは毎回no cut のものも並べているということでしょうか。
コンピテントセルは冷凍庫の管理が甘ければ劣化するでしょう。

(無題)

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No.6802-10 - 2018/04/05 (木) 16:28:27 - ひつじ

しばらく実験が滞っていたのでお答えできる内容が少なく、申し訳ないのですが、確認できたものだけ書き出します。

mon様
・抗生物質は溶液を分注したものをストックして用事に規定量入れるようにしていて、濃度が違うということは考えにくいです。

～様
・「温度」は何の温度をさすのでしょうか
・培地、抗生物質濃度、プラスミドは、これまで毎回（上手くいくいかない問わず）同じ組み合わせです。pCRII-TOPOベクターをTOP10コンピテントセルに、LB/Ampプレートから２xYT液体培地です。

DMR様
・２xYTのほうが菌量が増えると、慣例的に使っていますが、私自身は比較していませんでした。

おお様
・コンピテントセルはインビトロジェンの市販品です。
・LB培地は調整したのでこのあと試そうと思います。
・プレートのアンピシリンは、確かにへたっているかもしれません。これまで作って１ヶ月はもつようだったので１ヶ月ぎりぎりのプレートを使いましたが、ご指摘のようにアンピシリン失活が原因だったのかもしれません。

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No.6802-9 - 2018/04/03 (火) 02:09:25 - おお

2xYTとか培地のちょっとした違いでプラスミドが抜けやすくなるとかあるような気がするのですが、そういうことはめったに起こらないとも言えるので、、、

プレートがLBでそれで増えているのだから、プレートで使っているLBをアガロース抜きで作ってミニプレップするほうが問題点を見つけるという意味でもスッキリするのでは？

LBプレート作ったときの抗生物質がへたっている可能性はないかな。プラスミドはampとカナマイシン両方乗っているようだけど、ampを使っているならカナマイシンに変えてみてはどうかな。Ampより熱安定性はあるし。

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No.6802-8 - 2018/04/03 (火) 01:59:02 - おお

コンピテントが自作なら、そちらを疑ってみてもいいかもしれません。経験としては、ある研究室で作っていたコンピの濃度が非常に高く、バックグランドがよく出るということがありました。

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No.6802-7 - 2018/04/02 (月) 17:52:44 - DMR

シーケンスするためのプレップだったらLBで培養してさっさと先に進めてしまっては？
２×YTでないといかん理由があるんでしょうか？

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No.6802-6 - 2018/04/02 (月) 17:13:40 - ~

・温度
・培地（ロットや種類）
・抗生物質濃度
・プラスミド
あたりの確認や過去にうまくいっていったものの追試をしてみては。

すでに培地は作り直しても駄目という結果が出ていますので、
培地が原因という考えは捨てるタイミングでは。

(無題)

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No.6802-5 - 2018/04/02 (月) 13:36:37 - mon

原因の切り分けをしたら？
2xYT培地：抗生剤なしでplasimなしの大腸菌が増えるか？抗生剤いれてポジコン(過去に実績があるもの）が増えるか？
作り直しているので考えづらいですが、pHが中性付近でないとか？？？？
抗生剤の濃度を一桁間違えているとか？
元の大腸菌：LB-amp(?)Plateに線画培養して増えるか、否か。
インサートによって、同じ向きに入ったモノしか取れないとか、必ず失欠するとか、他のベクターにならOKだったとかの経験はありますが、なんか違う感じですね～。

(無題)

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No.6802-4 - 2018/04/02 (月) 11:27:15 - ひつじ

さっそくのお返事ありがとうございます。

おお様
プラスミドはpCRII-TOPOです。

中年様
LBに変えて増えた場合は2xYTが不適合だという解釈でしょうか？
過去に同様の作業をやっていて、継代したほぼ100%が増えていたので（今使っているロットの）2xYTの問題を疑ったという状況です。

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No.6802-3 - 2018/04/02 (月) 10:24:41 - 中年

液体培地をLBにしてはどうですか？（これで生えないなら別の話）

(無題)

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No.6802-2 - 2018/04/02 (月) 00:53:48 - おお

プラスミドなんですか？