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(無題) 削除/引用 No.6811-5 - 2018/04/04 (水) 10:40:49 - おお >透析液は10mMトリス、150mM塩が含まれたもののようです。これを陰イオン交換columnにかけているのですが、サンプル中に塩が入っていてもいいものなのか？ 150mM入っていてもゲルに吸着するのであればそれでいいです。もっと低い塩濃度で結合するものは吸着せずに流れてしまうので精製しやすいでしょう。 >欲しいものだけをよりcolumnに結合させたいからという理由があるのでしょうか？ 余分なものをなるべく吸着させないと言えるかもしれません。 >pHを7.4だけでなく、8.4、9.4と変えて、 Fig. 5. pH can alter resolution of a method. http://www.bio-rad.com/en-us/applications-technologies/ion-exchange-chromatography?ID=MWHAY9ESH 条件を探るのならやってみてもいいのかと思いますけど必ず分かれる条件があるかというのは保証できません。 硫安で特に沈殿させたものから回収するなら、透析でなくってゲルろ過でサイズで分画してからDEAEと言うのがいいのかもしれません。ゲルによっては硫安など高濃度の塩を含むとき疎水相互作用でついてしまうことはあるかもしれませんが、１５０mMの塩でクロマトする分には外れるのでそんなに気にしなくてもいいでしょう。疎水相互作用をするときはそれを逆手に取ってゲルろ過用のゲルで疎水クロマトで精製する人もいます。

(無題) 削除/引用 No.6811-4 - 2018/04/04 (水) 10:35:04 - AP ゲルクロマトグラフィーをするときは、非特異的吸着を起こすので基本的にある程度の塩濃度を与えておきます。150 mMというのは典型的な濃度だと思います。 まあこれはイオン交換担体の電荷を中和すると言うんじゃなくて、担体自体（セファロースなど）の電荷を中和するもんだと思えばいいと思います。逆に言えばイオン交換担体でないただのセファロースでも静電相互作用である程度、くっつくタンパク質があるので、それを防ぐということ。あるいは、標的がその塩濃度で外れないことが分かっているので、その塩濃度以下でくっつくタンパク質は最初から流してしまうということ。 タンパク質はかなり大きい分子なので、全体の等電点じゃなくてローカルな電荷でくっついたり離れたりすることはありえます。

(無題) 削除/引用 No.6811-3 - 2018/04/04 (水) 09:41:15 - qq DEAE-sephadexは、塩濃度を増加させると体積が減少する（と、聞いた）ので、塩濃度の変化を抑える意味で、150mMからスタートしている可能性もあるかもしれない。 DEAE-sephadexは古典的な担体なので、原著に従って、精製するほうが良いような気がします。 前任の方の場合、他のタンパク質のコンタミが多かったとのことですが、 １）硫安カットの条件をもう少し詰めるほうが良いのではないかと思います。 飽和硫安をドサッと入れるのか・ポタポタ丁寧に入れるのか、作業温度や撹拌時間はどうなっているのか、原著や実験書を確認するほうがよいかもしれません。 ２）硫安カットのあと、透析の代わりに細分画できるゲルろ過でサイズ分離し、活性画分をDEAE-sephadexに持ち込むのは、誰でも考えそうなことです。 但し、ゲルろ過は原著論文から外れるのかもしれないし、現段階で収率などが予測できないので、硫安分画を丁寧にやるのが良いのではないかなあ。

(無題) 削除/引用 No.6811-2 - 2018/04/04 (水) 08:56:45 - mon 初期塩濃度について、 試し分離の場合、低塩濃度での分離が見えないので低い方が良い。 目的物の結合に影響なければ余分な不純物が結合しないので、高塩濃度からスタートの方がカラムの負荷も少ないので望ましい。 低塩濃度にする（+長時間放置：透析時）と目的タンパクが沈殿(or失活）する場合がある。タンパクによってはMg,Ca,Zn,Fe等のイオン(10uM~1mM程度）が必要なものもあるので注意。 上記の理由で、試し打ちの場合、サンプルを開始bufferで直前に希釈してカラムにロードして分離パターンを調べる。本精製時、目的タンパクが溶出される塩濃度の半分（〜2/3）くらいでカラムにロードしています。 pHについて Theoretical pIはあくまでも参考値で、カラムへの結合に重要な表面電荷は不明です。 上手に設定出来れば、不純物との分離がよくなり綺麗に精製できます。 通常バッチ処理で目的タンパクの結合量が最大となる最適なpH条件を探索します。pHスカウティングが自動で出来る機器もあります。

陰イオン交換columnに供するサンプル中の塩 削除/引用 No.6811-1 - 2018/04/04 (水) 06:32:54 - 塩の効果 大変初歩的な質問かもしれませんが、陰イオン交換クロマトグラフィーを使ってクルードなサンプルから特定のものを精製する、という経験もしたことのない実験をするように言われました。 GEのイオン交換の初心者向けのサイトやプロトコル本などを読み、一応は理解したつもりです。 クルードサンプルはある生物の混合毒（シグマ社より購入）です。この混合毒から特定のタンパク質を精製するのが目的です。 渡されたレジンはDEAE-sephadexです。 渡された論文（90年代の論文で、混合毒から私の欲しいタンパク質を精製しています。）を見ますと、混合毒を硫安カットしたものを透析し、それをDEAE-sephadexにアプライしています。 大変素人ながら疑問に思ったことなのですが、論文によると透析液は10mMトリス、150mM塩が含まれたもののようです。これを陰イオン交換columnにかけているのですが、サンプル中に塩が入っていてもいいものなのか？と疑問に思いました。 私はてっきり陰イオン交換columnにかけるサンプルから塩を除くことをする”べき”だと思ったからです。 塩を含まない透析サンプルをcolumnにアプライしたのち、塩のグラジエントで溶出するものとばかり思っていたからです。 150mMを最初から入れている理由は、欲しいものだけをよりcolumnに結合させたいからという理由があるのでしょうか？それとも0から私はやってみてもいいのでしょうか？ もう一つ、私のタンパク質のTheoretical pIは6.76です。論文では透析液はpH7.4でした。なので陰イオン交換columnに結合できるのだと思います。 実はこの実験は同僚の方の実験だったのですが、その方が上の論文通りにやっても精製ができなかった（欲しいバンドの他に、もう一つ大きなコンタミのバンドがあったようで、それが一緒に溶出されてきてしまったようです。）ようで、それを手先の器用だという理由だけで私に回ってきました。当方アメリカ留学中です。 コンタミを減らすため、pHを7.4だけでなく、他のpHも振ることは有効でしょうか？ GEは塩とpHがイオン交換には大事と書かれてありました。たとえば、pHを7.4だけでなく、8.4、9.4と変えて、グラジエントで塩で溶出すると2つのバンドが分かれる可能性というのはありますでしょうか？ 大変初歩的な質問だと思います。私も自分の時間が取られてしまい苦しいのですが、皆様からアドバイスがいただけると非常に心強いです。どうかよろしくおねがいいたします。

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