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PFA固定/膜透過処理したセルラインは4度で保存できますか？ トピック削除
No.6823-TOPIC - 2018/04/08 (日) 02:32:24 - 李
いつ勉強させていただいています。

この度、セルラインをスライドグラス上に撒き、ある一過性発現タンパク質の細胞内局在を検討を目的として以下の実験を考えています。

1.　あるタンパク質に対するタグ抗体と、様々なオルガネラ特異的抗体を共染色して、ざっくりこれかもしれん、という局在を調べる。

2.　その妥当性を検討するため、たとえば1でゴルジ体であれば、B4galT、GM130、TGN46などと詳細なゴルジ体マーカーで共染色する。

というものです。1と2は同じ日にできる可能性は低く、トランスフェクションが必要など煩雑さもあり、できれば2（固定したもの？あるいは固定+膜透過処理したもの）を翌日まで4度で保存できればと考えています。

タグタンパク質はゴルジ体にあるものと思われます。

質問は、もしその未染色のサンプルを翌日以内に使う予定であれば、どのような保存の仕方が良いでしょうか？？もちろん固定はすると思いますので、PFA固定してPBSで複数回洗浄後、

1.　PBSを加え、翌日まで4度保存
2.　膜透過処理（0.05％Tx100、5分）後、PBSを加え、翌日まで4度保存
3.　膜透過処理（0.05％Tx100、5分）後、1%BSA in PBSを加え、翌日まで4度保存
4.　膜透過処理（0.05％Tx100、5分）後、1%BSA in PBS-T (0.05% Tx100)を加え、翌日まで4度保存

が考えられますが、どれがベターでしょうか？
3が安全かな、、と思いますが、いつも固定後染色をする際には、4のブロッキングバッファーを加え、ブロッキング後（R.T.一時間）、染色しています。

大変初歩的なことで、ケースバイケースかもしれませんが、みなさまからのご意見をいただけますと幸いです。よろしくおねがいします。
　
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No.6823-5 - 2018/04/08 (日) 12:51:52 - 李
PYKさん、

なるほど！メイクセンスです。納得です！ありがとうございます＾＾

(無題) 削除/引用
No.6823-4 - 2018/04/08 (日) 10:50:39 - PYK
すいません。言葉足らずでした。
私はブロッキングバッファーにTritonやSaponinは入れていません。
膜透過処理の時のみです。
ですので、4度で保存する時、BSA-PBS without detergentになっています。

(無題) 削除/引用
No.6823-3 - 2018/04/08 (日) 06:18:16 - 李
PYKさん、ありがとうございます！
なるほど、一週間もいけるんですね！！

デタージェントが入っている状態で、数日間保存するのが怖かったですが、一度やってみます^^
ありがとうございます。

(無題) 削除/引用
No.6823-2 - 2018/04/08 (日) 06:10:36 - PYK
染色する抗体にもよりますが、トピ主さんがおっしゃるようなTGN46やGM130、もしくは有名なオルガネラマーカー（EEA1、LAMP1、Transferrin receptor、Tom20、LC3など）は、1-4どのステップでも問題ないと思います。
また、用いる細胞株にもよると思います。HEKやHeLa、COS細胞などならいずれのステップで4度保存しても大丈夫かと思います。
個人的にはいつもPFA固定し、Triton or Saponin処理したのち、ブロッキングバッファーで4度保存しています。上記の抗体で染色するなら、1週間くらいは保存可です。
また私は、トピ主さんがおっしゃる3のBSA-PBSで1次抗体、2次抗体の染色を行なっていますので、染色する場合はブロッキングの工程をせず、抗体染色を行なっています。
参考になれば幸いです。

PFA固定/膜透過処理したセルラインは4度で保存できますか？ 削除/引用
No.6823-1 - 2018/04/08 (日) 02:32:24 - 李
いつ勉強させていただいています。

この度、セルラインをスライドグラス上に撒き、ある一過性発現タンパク質の細胞内局在を検討を目的として以下の実験を考えています。

1.　あるタンパク質に対するタグ抗体と、様々なオルガネラ特異的抗体を共染色して、ざっくりこれかもしれん、という局在を調べる。

2.　その妥当性を検討するため、たとえば1でゴルジ体であれば、B4galT、GM130、TGN46などと詳細なゴルジ体マーカーで共染色する。

というものです。1と2は同じ日にできる可能性は低く、トランスフェクションが必要など煩雑さもあり、できれば2（固定したもの？あるいは固定+膜透過処理したもの）を翌日まで4度で保存できればと考えています。

タグタンパク質はゴルジ体にあるものと思われます。

質問は、もしその未染色のサンプルを翌日以内に使う予定であれば、どのような保存の仕方が良いでしょうか？？もちろん固定はすると思いますので、PFA固定してPBSで複数回洗浄後、

1.　PBSを加え、翌日まで4度保存
2.　膜透過処理（0.05％Tx100、5分）後、PBSを加え、翌日まで4度保存
3.　膜透過処理（0.05％Tx100、5分）後、1%BSA in PBSを加え、翌日まで4度保存
4.　膜透過処理（0.05％Tx100、5分）後、1%BSA in PBS-T (0.05% Tx100)を加え、翌日まで4度保存

が考えられますが、どれがベターでしょうか？
3が安全かな、、と思いますが、いつも固定後染色をする際には、4のブロッキングバッファーを加え、ブロッキング後（R.T.一時間）、染色しています。

大変初歩的なことで、ケースバイケースかもしれませんが、みなさまからのご意見をいただけますと幸いです。よろしくおねがいします。
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